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Abstract
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암 연구학

CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価

Published: February 28, 2021
doi:
10.3791/61557
, , , ,
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center,University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center,University of Ulsan College of Medicine

Summary

BRCA1突然変異を有する人々は、BRCA1変異体の機能の正確な評価を保証する癌を発症するリスクが高い。本明細書において、生細胞における標的C:GからT:A変換を可能にするCRISPR媒介シトシンベースエディタを用いたBRCA1変異体の機能評価用プロトコルについて説明した。

Abstract

最近の研究では、蛍光レポーターアッセイ、胚性幹細胞生存アッセイ、治療用薬物ベースの感受性アッセイなどの様々な機能評価方法を用いて 、BRCA1 遺伝子変異に関連するリスクを調査しています。彼らは多くの BRCA1 変異体を明らかにしているが、外因的に発現した BRCA1 変異体の使用を含むこれらのアッセイは過剰発現の問題に関連しており、転写後の調節には適用できない。これらの制限を解決するために、我々は以前、生細胞における標的ヌクレオチド置換を誘導するCRISPR媒介シトシン塩基エディタを介して BRCA1 変異体の機能分析方法を報告した。この方法を使用して、c.-97C>T、c.154C>T、c.3847C>T、c.5056C>T、c.4986+5G>Aなど、関数があいまいなままのバリアントを特定し、CRISPRメディア化された基本エディタが BR1の不確定な変異体の再分類に役立つことを確認しました。ここでは、CRISPRベースのシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能解析用プロトコルについて説明する。このプロトコルは、ターゲット・サイトの選択、機能分析、 および BRCA1 バリアントの評価に関するガイドラインを提供します。

Introduction

乳癌タイプ1感受性遺伝子(BRCA1)は、広く知られている腫瘍抑制遺伝子である。BRCA1遺伝子はDNA損傷の修復に関連しているため、この遺伝子の変異は、個体1における癌発症のリスクが高くなる。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および膵臓癌はBRCA1遺伝子2の遺伝性機能喪失(LOF)突然変異に関連している。BRCA1変異体の機能評価および同定は、様々な疾患の予防および診断に役立つ可能性がある。BRCA1変異体の機能に対処するために、胚性幹細胞生存アッセイ、蛍光レポーターアッセイ、および治療用薬物ベースの感受性アッセイ3、4、5、6などのBRCA1変異体の病原性を調査するために、いくつかの方法が開発され、広く使用されている。これらの方法は多くのBRCA1変異体の機能を評価しているが、外因的に発現したBRCA1変異体を含む方法は、下流の調節、遺伝子投与量、およびタンパク質折りたたみ7に影響を及ぼす可能性のある過剰発現の点で制限をもたらす。さらに、これらのアッセイは、mRNAスプライシング、転写安定性、および非翻訳領域8,9の効果などの転写後の調節に利用することができない。

CRISPR-Cas9システムは、生きている細胞および生物10における標的ゲノム編集を可能にする。単一ガイドRNAを介して、Cas9は、エラーが起こりやすい非相同性末端結合(NHEJ)経路およびエラーを起こしやすい相同性指向修復(HDR)経路11の2つのDNA修復経路を活性化するために、特定のゲノム遺伝子座で染色体DNA中の二本鎖切断(DSB)を誘導することができる。HDR は、正確な修復メカニズムです。しかし、HDRのCas9ヌクレアーゼによって誘導されたDSBは、しばしば望ましくない挿入および欠失(indel)突然変異をもたらす。さらに、DNA損傷を修復するための相同なドナーDNAテンプレートが必要であり、効率が比較的低い。最近、Cas9ニッカーゼ(nCas9)は、C:GからT:Aの置換を標的とするシチジンデアミネーゼドメインと融合しており、相同なDNAテンプレートおよびDNA二重鎖破断12、13、14、15を必要としない。シトシンベースエディタを用いて、BRCA1バリアント16の機能解析のための新しい方法を開発しました。

本研究では、BRCA1変異体の機能評価を実施するために、効率的なC:GからT:A点突然変異を誘導するCRISPR媒介シトシンベースエディタBE314を用いて、いくつかのBRCA1変異体の機能を同定することに成功した(図1)。

Figure 1
図 1: 機能評価のワークフローの概要(A) BRCA1の機能評価を示す回路図。 BRCA1 のLOFは細胞の生存率に影響を与えるので 、BRCA1 突然変異が病原性である場合、細胞は通過数が増加するにつれて死ぬ。(B) BRCA1の機能評価の段階 。ドット ボックスはオプションです。それは、プラスミドDNAを発現するgRNAとBE3の共トランスフェクションに置き換えることができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

注: 方法 1 (HAP1-BE3 セルラインの生成) はオプションです。BE3発現細胞株を構築する代わりに、BE3コード系プラスミドDNAをgRNAコードプラスミドDNAと共にトランスフェクトすることができる。BE4max のようなシトシンベースエディタの他のバリアントも、高効率なベース編集に使用できます。 1. HAP1-BE3細胞株の生成 プラスミドDNAの構築 レンチウイルス産生用レン…

Representative Results

このプロトコルに記載された実験的アプローチは、CRISPRベースのシトシンベースエディタによって生成される内因性 BRCA1 変異体の機能評価を可能にする。 BRCA1 変異体の機能評価に適切な細胞株を選択するには、研究者は 、BRCA1 が標的細胞株に不可欠な遺伝子であることを確認する必要があります。例えば、まずCas9とgRNAをHAP1細胞株にトランスフェクトして BRCA1 を…

Discussion

このプロトコルは、CRISPR-瞑想されたシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能評価のための簡単な方法を説明する。プロトコルは、標的遺伝子座におけるgRNAの設計とそれらが発現するプラスミド・ドナの構築のための方法を記述する。シトシン塩基エディタは、活性ウィンドウでヌクレオチド変換を誘導する(BE3の場合、gRNA標的配列のPAM-遠位末端のヌクレオチド4〜8)。アク?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、韓国国立研究財団(助成金2017M3A9B4062419、2019R1F1F1F1057637、2018R1A5A2020732 Y.K.に支援されました)。

Materials

BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme
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References

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See, J., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).
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