유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

요약

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8⁺ T 세포를 수용하고 비 점막 T_RM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

조직-주민 기억 T 세포 (T_RM)는면역학 연구의 급속하게 확장 분야입니다. 다양한 비 림프구 조직에서 T 세포를 격리하는 것은 T_RMs를 조사하는 주요 단계 중 하나입니다. 다른 장기에 대한 림프구 절연 프로토콜에는 약간의 변화가 있습니다. 신장은 병원체 노출 또는 자가 면역 활성화 후에 특히 수많은 면역 세포 침투를 가진 필수적인 비 림프구 기관입니다. 최근 몇 년 동안, 우리 자신의 여러 실험실은 마우스와 인간 모두에서 다양한 생리 및 병리학 적 설정에서 신장 거주자 CD8⁺ T 세포를 특성화하기 시작했다. T 림프구의 풍부로 인해 신장은 비 점막 또는 비 장벽 조직에서 T_RMs를 연구하는 매력적인 모델 기관을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 전신 바이러스성 감염 다음 마우스 신장에서 CD8⁺ T 세포를 격리하기 위하여 T_RM집중한 실험실에서 일반적으로 이용되는 프로토콜을 설명할 것입니다. 간략하게, C57BL/6 마우스에서 급성 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 감염 모델을 사용하여, 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하기 위해 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하는 진래성 CD8⁺ T 세포 라벨링, 밀도 그라데이션 원심을 시연하여 후속 사이클분석을 위한 시료를 준비하고 있다.

서론

조직-상주 기억(T_RM)T 세포는 성인 인간 및 감염된 마우스에서 가장 풍부한 T 세포 집단 중 하나를 나타낸다. T_RM 세포는 면역 방어의 첫 번째 라인을 제공하고 다양한 생리학적 및 병리학^적과정에 비판적으로^{관여1,2,3,4,5.} 순환 T 세포와 비교하여 T_RM 세포는 고유한 전사 프로그램^6,7,8을가진 뚜렷한 표면^마커를운반한다. T_RM 생물학에 대한 지식을 확장하는 것은 T 세포 기반 백신 및 면역 요법의 미래 발달에 필수적인 T 세포 반응을 이해하는 열쇠입니다.

모든 비 림프구 조직에 걸쳐 T_RMs의일반적으로 공유 분자 마커 이외에, 축적 증거는 조직 특정 특징이 T_RM

프로토콜

이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명 된 모든 절차는 IACUC UT 건강 샌 안토니오에 의해 승인되었습니다.

1. P14 T 세포의 채택 전달 C57BL/6 받는 사람 및 LCMV 감염

1. 6-12 주에 P14 마우스를 사용 하십시오. 기증자 P14 TCR 형질전환 마우스의 성별이 C57BL/6 받는 쥐의 성별과 일치해야 하는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 암컷 마우스로 옮겨지는 남성 T 세포와 같은 세포는 12일 경에 순환하는 기증자 T 세포의 면역 매개 거부를 초래할 것이다^14.
2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 마우스 CD8⁺ T 세포 정화 키트를 사용하여 P14 TCR 형질형 마우스의 비장 및 림프절에서 순진한 CD8⁺ T 세포를 정화합니다.
   1. 간략하게 비장과 림프절을 해부하고 샘플을 으깨서 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
   2. 순진한 T 세포를 농축하려면, 제1 항체 인큐베이션^{단계(13)에서}비오틴 항 CD44 항체를 첨가한다.
      참고: 이 단계에서 사용되는 음....

결과

여기에 설명된 프로토콜은 플로우차트(그림 1A)로요약되어 있습니다. 30 일째LCMV 감염, 우리는 CD8⁺ T 세포의 내트라바스큘러 라벨링을 수행했습니다. 5분 후, 동물의 두 신장은 해부되고, 다진 후 콜라게나아제 소화를 당했습니다. 림프구는 Percoll 원심분리를 통해 소화된 시료로부터 더 정제되었고 유동 세포측정에 의해 분석되었다. 도 1B에도시된 바와 같이, 밀도 원심분리-매개 림프구 농축 후에도 최종 제품에서 비 림프구의 상당 부분을 보는 것이 매우 일반적이었다. 그러나, 살아있는 림프구에 게이팅 후, CD8⁺ T 림프구를 쉽게 식별 할 수 있었다. 우리는 항암 CD8⁺ T 세포를 구별 할 수 있습니다. CD8⁺ T 세포에 CD8α 및 CD8β의 높은 상관발식 패턴으로 인해, CD8α-CD8β FACS 프로파일에 대각선 패턴을 나타낼.......

토론

조직 특정 면역은 연구의 급속한 확장 영역으로, 축적 증거는 면역 세포, 특히 림프구 인구성인 인간 또는 감염 또는 예방 접종 마우스에 거의 모든 기관에서 식별 될 수 있음을 시사한다. LCMV 마우스 감염 모델은 여러 조직에 걸쳐 T_RM 생물학을 포함하는 항원 특이적 T 세포 반응, 이펙터 및 메모리 T 세포 분화를 연구하는 잘 확립된 모델이다. 여기서, 우리는 신장에 있는 CD8⁺ T 세포를 분석하는 프로토콜을 기술했습니다. 이 프로토콜은 T_RM^12에초점을 맞춘 출판물에서 크게 조정됩니다. 아마도 높은 수준의 P2RX7 발현 및 효소 소화 유도 세포^{사멸(15)으로}인해, 전류 프로토콜로부터 림프구 수율은 즉각적인 표현성 분석에 가장 적합하다. 그러나, P2RX7 유도세포사멸을억제하는 확립된 프로토콜을 통해, 현재 의정서가 쉽게 변형될 수 있다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisherbrand	05-408-130
15ml 원추형 튜브	Corning	431470
3ml 주사기	BD	309657
37C 인큐베이터	VWR
Biotin a-CD8a 항체(클론 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
송아지 혈청	GE Healthcare Life 과학	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
일회용 졸업 전사 피펫	Fisherbrand	13-711-9AM
인슐린 주사기	BD	329424
마이크로 해부 스프링 가위	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naï ve T 세포 분리 키트	Biolegend	480043
오버헤드 열 램프	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
로커	VWR
RPMI	GE HEALTHCARE 생명 과학	SH30096.01
솔리드 황동 마우스 Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
스윙 버킷 원심분리기(냉장고 포함	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516

)