Isolering af musenyrnyre resident CD8+ T-celler til flowcytometrianalyse
Summary
Efter virusinfektion, nyre havne et relativt stort antal CD8+ T-celler og giver mulighed for at studere ikke-slimhinde TRM celler. Her beskriver vi en protokol til at isolere mus nyre lymfocytter for flow cytometri analyse.
Abstract
Væv-hjemmehørende hukommelse T-celle (TRM)er et hastigt voksende område af immunologi forskning. Isolering T-celler fra forskellige ikke-lymfoide væv er et af de vigtigste skridt til at undersøge TRMs. Der er små variationer i lymfocyt isolation protokoller for forskellige organer. Nyre er et vigtigt ikke-lymfoide organ med talrige immuncelleinfiltration især efter patogen eksponering eller autoimmun aktivering. I de seneste år, flere laboratorier, herunder vores egen er begyndt at karakterisere nyre hjemmehørende CD8+ T-celler i forskellige fysiologiske og patologiske indstillinger i både mus og menneske. På grund af den overflod af T lymfocytter, nyre repræsenterer en attraktiv model organ til at studere TRMs i ikke-slimhinde eller ikke-barriere væv. Her vil vi beskrive en protokol, der almindeligvis anvendes i TRM-fokuseredelaboratorier til at isolere CD8+ T-celler fra musenyrerne efter systemisk virusinfektion. Kort, ved hjælp af en akut lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) infektion model i C57BL/6 mus, vi demonstrere intravaskulære CD8+ T celle mærkning, enzymatisk fordøjelse, og densitet gradient centrifugering at isolere og berige lymfocytter fra musenyrer at gøre prøverne klar til den efterfølgende flow cytometri analyse.
Introduction
Væv-hjemmehørende hukommelse (TRM)T-celler repræsenterer en af de mest rigelige T-celle populationer i voksne mennesker og inficerede mus. TRM-celler giver den første linje i immunforsvaret og er kritisk involveret i forskellige fysiologiske og patologiskeprocesser 1,2,3,4,5. Sammenligne med cirkulerende T-celler, TRM celler bære forskellige overflade markører med unikke transskriptionprogrammer 6,7,8. Udvidelse af vores viden om TRM biologi er nøglen til at forstå T celle svar, som er afgørende for den fremtidige udvikling af T-celle-baserede vacciner og immunterapier.
Ud over almindeligt delte molekylære markører for TRMs på tværs af alle ikke-lymfoide væv, akkumulere beviser tyder på, at væv-specifikke funktioner er en central del af TRM biologi9. Nyre havne mange immunceller, herunder TRM celler efter infektion og giver en stor mulighed for at studere TRM cellebiologi i en ikke-slimhindevæv. Akut LCMV (lymfocytisk choriomeningitis virus) infektion via intraperitoneal rute er en veletableret systemisk infektion model til at studere antigen-specifikke T-celle reaktioner i mus. Infektionen er normalt forsvandt i 7-10 dage i vilde type mus og efterlade et stort antal LCMV-specifikke hukommelse T-celler i en række væv, herundernyrerne 10. P14 TCR (T-celle receptor) transgene mus bære CD8+ T-celler genkende en af de immun-dominerende epitoper af LCMV præsenteret af MHC-I (klasse I større histokompatibilitet kompleks) molekyle H2-Db i C57BL/6 mus. Ved at kombinere medfødt markeret P14 T celle adoptivoverførsel og LCMV infektion i mus, CD8+ effektor og hukommelse T-celler spores, herunder TRM differentiering og homøostase.
I nogle barriere væv, såsom intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) rum og spytkirtler, etablerede lymfocyt isolation procedure giver høj procentdel af TRM celler med minimal blodbårne T-celle forurening i mus LCMV model11. Men i ikke-barriere væv, såsom nyrerne, tæt vaskulære netværk indeholder et stort antal cirkulerende CD8+ T-celler. Det er blevet veldokumenteret, at selv vellykket perfusion ikke effektivt kan fjerne alle cirkulerende CD8+ T-celler. For at overvinde denne tekniske hurdle, intravaskulær antistof farvning er blevet etableret som en af de mest almindeligt anvendte teknikker i TRM labs12. Kort sagt, 3-5 minutter før aktiv dødshjælp, 3 μg/mus anti-CD8 antistof (for at mærke CD8+ T-celler) leveres intravenøst. Intakt blodkar væg forhindrer hurtig diffusion af antistoffet inden for denne korte periode (dvs. 3-5 minutter) og kun intravaskulære celler er mærket. Efter standard lymfocyt isolation protokol, intravaskulær versus ekstravaskulære celler kan let skelnes ved hjælp af flow cytometri.
Her vil vi beskrive en standardprotokol, der almindeligvis anvendes i TRM labs til at udføre intravaskulær mærkning, lymfocytisolering og flow cytometri analyse af nyre CD8+ T-celler ved hjælp af en C57BL/6 mus, der har modtaget CD45.1+ P14 T-celler og LCMV infektion 30 dage før13. Samme protokol kan bruges til at studere både effektor og hukommelse T-celler i nyrerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som vævsspecifik immunitet er et hurtigt voksende forskningsområde, tyder akkumulerende beviser på, at immunceller, især lymfocytter befolkning kan identificeres i næsten alle organer i voksne mennesker eller inficerede eller immuniserede mus. LCMV mus infektion model er en veletableret model til at studere antigen-specifikke T-celle respons, effektor og hukommelse T celle differentiering herunder TRM biologi på tværs af flere væv. Her beskrev vi en protokol til at analysere CD8+ T-celler i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud AI125701 og AI139721, Cancer Research Institute CLIP program og American Cancer Society tilskud RSG-18-222-01-LIB til N.Z. Vi takker Karla Gorena og Sebastian Montagnino fra Flow Cytometri Facility. Data genereret i Flow Cytometri Shared Resource Facility blev støttet af University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA), NIH/ NCI tilskud P30 CA054174-20 (Klinisk og Translationel Research Center [CTRC] på UTHSCSA), og UL1 TR001120 (Klinisk og Translationel Science Award).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
