Differenziazione dei monociti in macrofagi fenotipicamente distinti dopo il trattamento con esosomi derivati dalle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale umano (CB-SC)
Summary
L’applicazione esosoma è uno strumento emergente per lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Stabiliamo un protocollo di isolamento esosoma ad alta purezza per isolare gli esosomi dalle nuove cellule staminali identificate chiamate CB-SC per studi meccanicistici. Cocoliamo anche esosomi derivati dal CB-SC con monociti umani, portando alla loro differenziazione in macrofagi fenotipicamente distinti.
Abstract
La terapia con educatore di cellule staminali (SCE) è un nuovo approccio clinico per il trattamento del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni. La terapia SCE fa circolare le cellule mononucleari del sangue del paziente isolato (ad esempio linfociti e monociti) attraverso una macchina di aferesi, co-coltura le cellule mononucleari del sangue del paziente con cellule staminali derivate dal sangue del cordone ombelicale aderenti (CB-SC) nel dispositivo SCE, quindi restituisce queste cellule immunitarie “istruite” al sangue del paziente. Gli esosomi sono vescicole extracellulari di dimensioni nanometriche tra 30\u2012150 nm esistenti in tutti i mezzi di coltura biofluida e cellulare. Per esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari alla base della terapia SCE e determinare le azioni degli esosomi rilasciati da CB-SC, studiamo quali cellule fagocitizzano questi esosomi durante il trattamento con CB-SC. Co-coltivando esosomi derivati dal CB-SC con cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC), abbiamo scoperto che gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati prevalentemente ripresi da monociti positivi al CD14 umano, portando alla differenziazione dei monociti nei macrofagi di tipo 2 (M2), con morfologia simile al mandrino ed espressione dei marcatori molecolari superficiali associati all’M2. Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento e la caratterizzazione degli esosomi derivati da CB-SC e il protocollo per la co-coltura di esosomi derivati da CB-SC con monociti umani e il monitoraggio della differenziazione M2.
Introduction
Le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (CB-SC) sono un tipo unico di cellule staminali identificate dal sangue del cordone ombelicale umano e si distinguono da altri tipi noti di cellule staminali come le cellule staminali mesenchimali (MSC) e le cellule staminali ematopoietiche (HSC)1. Sulla base delle loro proprietà uniche di modulazione immunitaria e della loro capacità di aderire strettamente alla superficie delle piastre di Petri, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia designata come terapia di educatore delle cellule staminali (SCE) negli studiclinici 2,3. Durante la terapia SCE, le cellule mononucleari del sangue periferico di un paziente (PBMC) vengono raccolte e circolate attraverso un separatore cellulare e co-coltivate con CB-SC aderente in vitro. Queste cellule “istruite” (PBMC trattato con CB-SC) vengono quindi restituite alla circolazione del paziente in un sistema a circuito chiuso. Studi clinici hanno già dimostrato la sicurezza clinica e l’efficacia della terapia SCE per il trattamento di malattie autoimmuni tra cui diabete di tipo 1 (T1D)2,4 e alopecia areata (AA)5.
Gli esosomi sono una famiglia di nanoparticelle con diametri che vanno da 30\u2012150 nm ed esistono in tutti i mezzi di coltura biofluida ecellulare 6. Gli esosomi sono arricchiti con molte molecole bioattive tra cui lipidi, mRNA, proteine e microRNA (miRNA) e svolgono un ruolo importante nelle comunicazioni da cellula a cellula. Negli ultimi tempi, gli esosomi sono diventati più attraenti per i ricercatori e le aziende farmaceutiche a causa delle loro potenzialità terapeutiche nellecliniche 7,8,9. Recentemente, i nostri studi meccanicistici hanno dimostrato che gli esosomi rilasciati da CB-SC contribuiscono alla modulazione immunitaria della terapia SCE10.
Qui descriviamo il protocollo per esplorare il meccanismo della terapia SCE che prende di mira i monociti da esosomi rilasciati da CB-SC. In primo luogo, gli esosomi rilasciati dal CB-SC sono stati isolati dai supporti condizionati derivati da CB-SC utilizzando metodi di ultracentrifugazione e convalidati dalla citometria del flusso, dalla western blot (WB) e dalla diffusione dinamica della luce (DLS). In secondo luogo, gli esosomi derivati dal CB-SC sono stati etichettati con un colorante lipofilo fluorescente verde: Dio. In terzo luogo, sono stati co-coltivati con PBMC per esaminare le percentuali positive di esosomi derivati da CB-SC con etichetta Dio alle diverse sottopopolazioni di PBMC per citometria a flusso. Questo protocollo fornisce indicazioni per studiare l’azione degli esosomi alla base della modulazione immunitaria delle cellule staminali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’applicazione di esosomi è un campo emergente per la diagnosi clinica, lo sviluppo di farmaci e la medicina rigenerativa. Qui presentiamo un protocollo dettagliato riguardante la preparazione di esosomi derivati dal CB-SC e lo studio funzionale degli esosomi sulla differenziazione dei monociti umani. L’attuale protocollo ha dimostrato che gli esosomi funzionali derivati da CB-SC sono isolati dalla centrifugazione sequenziale e dall’ultracentrifugazione con elevata purezza ed espongono la modulazione immunitaria sui mon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Poddar e Ludwig per il generoso sostegno finanziario tramite la Hackensack UMC Foundation. Apprezziamo Laura Zhao per l’editing in inglese.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. 의학. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
