Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires
Summary
Présenté ici est un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de super-résolution dans le tissu intact. Nous avons normalisé les conditions d’imagerie d’une population de cellules souches adultes très sensibles dans son environnement tissulaire natif. Cette technique consiste à équilibrer la résolution temporelle et spatiale pour permettre l’observation directe des phénomènes biologiques dans les tissus vivants.
Abstract
Il y a longtemps eu un compromis crucial entre la résolution spatiale et temporelle en imagerie. L’imagerie au-delà de la limite de diffraction de la lumière a traditionnellement été limitée à être utilisée uniquement sur des échantillons fixes ou des cellules vivantes en dehors des tissus marqués avec un signal fluorescent fort. Les techniques actuelles d’imagerie de cellules vivantes à super-résolution nécessitent l’utilisation de sondes de fluorescence spéciales, un éclairage élevé, des acquisitions d’images multiples avec traitement post-acquisition, ou souvent une combinaison de ces processus. Ces conditions préalables limitent considérablement les échantillons biologiques et les contextes auxquels cette technique peut être appliquée.
Nous décrivons ici une méthode pour effectuer une super-résolution (~ 140 nm XY-résolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. Cette technique est également compatible avec une faible intensité fluorescente, par exemple, EGFP ou mCherry marqué de manière endogène à des gènes faiblement exprimés. Comme preuve de principe, nous avons utilisé cette méthode pour visualiser plusieurs structures subcellulaires chez le testicule de drosophile. Pendant la préparation de tissu, la structure cellulaire et la morphologie de tissu sont maintenues dans le testicule disséqué. Ici, nous utilisons cette technique pour imager la dynamique des microtubules, les interactions entre les microtubules et la membrane nucléaire, ainsi que la fixation des microtubules aux centromères.
Cette technique nécessite des procédures spéciales pour la préparation des échantillons, le montage des échantillons et l’immobilisation des échantillons. De plus, les échantillons doivent être conservés pendant plusieurs heures après la dissection sans compromettre la fonction et l’activité cellulaires. Bien que nous ayons optimisé les conditions d’imagerie en direct à super-résolution spécifiquement dans les cellules souches germinales mâles (GSC) de la drosophile et les cellules germinales progénitrices dans le tissu de testicule disséqué, cette technique est largement applicable à une variété de types de cellules différents. La capacité d’observer les cellules dans leurs conditions physiologiques sans sacrifier la résolution spatiale ou temporelle sera un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à aborder des questions cruciales en biologie cellulaire.
Introduction
La visualisation des structures subcellulaires et de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec une résolution supérieure à la limite de diffraction de la lumière est généralement très difficile1-3. Alors que plusieurs techniques de super-résolution telles que la microscopie stochastique-optique-reconstruction-microscopie (STORM), la photo-activité-localisation-microscopie (PALM) et la microscopie à émission stimulée (STED)4,5,6 ont été développées, les complications dans la préparation des échantillons ainsi que la nécessité de maintenir la viabilité et l’activité ex vivo, limitent l’utilisation de la microscopie à super-résolution conventionnelle pour l’imagerie d’échantillons vivants. La microscopie confocale conventionnelle ne peut pas atteindre une résolution spatiale au-delà de ~230 nm XY-résolution et est souvent insuffisante pour observer des sous-structures cellulaires complexes5,6. Cependant, un développement récent en microscopie confocale, l’imagerie à super-résolution Airyscan, est capable d’atteindre environ 140 nm (résolution XY)7,8 et dispose d’une préparation d’échantillon relativement simple compatible avec l’imagerie en direct. Étant donné que ce système de détection d’imagerie nécessite un long temps d’acquisition, sa haute résolution spatiale se fait au détriment de la résolution temporelle9. Par conséquent, une méthode est nécessaire pour s’assurer que l’imagerie des cellules vivantes est étendue avec une résolution spatiale élevée.
Ici, nous avons développé une méthode pour observer des cellules vivantes dans le tissu intact à sa résolution optimale pour déchiffrer des structures subcellulaires avec des informations spatiales détaillées. Cette méthode est conçue comme telle de manière à ce que les échantillons puissent être montés de manière stable pendant une longue période de temps (~ 10 h) sans bouger ni dégénérer. Les milieux cellulaires vivants utilisés dans cette technique peuvent prendre en charge la fonction cellulaire et éviter le photobleaching jusqu’à 10 heures sous un microscope à super-résolution. Enfin, ce protocole minimise la plupart des stress causés par l’éclairage constant des lasers sur de longues périodes de temps telles que l’hypoxie, les changements d’humidité et de température, ainsi que l’épuisement des nutriments.
En utilisant ce protocole pour imager les cellules souches germinales mâles (CSG) de la drosophile, nous avons pu observer comment l’activité asymétrique des microtubules permet une interaction préférentielle avec des chromatides sœurs épigénétiquement distinctes10,11,12,13. Ces types d’événements cellulaires sont très dynamiques et sont très difficiles à visualiser dans les cellules vivantes à l’aide d’autres méthodes d’imagerie à super-résolution telles que STORM, PALM ou STED. Nous prévoyons que cette méthode deviendra très utile pour les biologistes cellulaires car ils visent à comprendre les structures subcellulaires dynamiques des cellules vivantes résidant dans les tissus. Il existe de nombreux domaines dans lesquels cette méthode peut être appliquée, tels que l’étude de la dynamique des protéines; comprendre le mouvement des cellules; et le traçage de lignée et les processus de différenciation cellulaire, entre autres applications possibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes de microscopie à super-résolution fournissent une résolution spatiale aussi élevée que 10s de nanomètres4,5,6. Les méthodes de microscopie STORM et PALM permettent une résolution allant jusqu’à 20 à 50 nm (résolution XY), tandis que la microscopie STED offre une résolution de 20 à 100 nm (résolution XY). La résolution spatiale de la microscopie SIM est limitée à 100 à 130 nm15. Cepend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l’installation Integrated Imaging Core de l’Université Johns Hopkins pour ses microscopes et ses logiciels d’analyse de données. Nous remercions J. Snedeker et Q. E. Yu pour la relecture et les suggestions, et les membres du laboratoire X.C. pour leurs discussions et suggestions utiles. Soutenu par nigms/NIH R35GM127075, le Howard Hughes Medical Institute, la Fondation David et Lucile Packard et les fonds de démarrage de l’Université Johns Hopkins (X.C.).
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
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