הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים
Summary
מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.
Abstract
זה זמן רב יש החלפה מכרעת בין רזולוציה מרחבית וטמפורלית בהדמיה. הדמיה מעבר למגבלת עקיפה של אור הוגבלה באופן מסורתי לשימוש רק על דגימות קבועות או תאים חיים מחוץ לרקמה המסומנת באות פלואורסצנטי חזק. טכניקות הדמיית תאים חיים ברזולוציית-על הנוכחית דורשות שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות מיוחדות, תאורה גבוהה, רכישות מרובות של תמונות עם עיבוד לאחר הרכישה, או לעתים קרובות שילוב של תהליכים אלה. תנאים מוקדמים אלה מגבילים באופן משמעותי את הדגימות וההקשרים הביולוגיים שניתן ליישם טכניקה זו.
כאן אנו מתארים שיטה לביצוע רזולוציית-על (~ 140 ננומטר XY-רזולוציה) זמן לשגות הדמיית תאים חיים במקום. טכניקה זו תואמת גם עם עוצמה פלואורסצנטית נמוכה, למשל, EGFP או mCherry אנדוגנית מתויגת בגנים בעלי ביטוי נמוך. כהוכחה לעיקרון, השתמשנו בשיטה זו כדי לדמיין מבנים תת-תאיים מרובים באשך Drosophila. במהלך הכנת הרקמה, הן המבנה התאי והן מורפולוגיה של הרקמות נשמרים בתוך האשכים הניתחו. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לדמיין דינמיקה microtubule, האינטראקציות בין microtubules ואת הממברנה הגרעינית, כמו גם את החיבור של microtubules כדי centromeres.
טכניקה זו דורשת הליכים מיוחדים בהכנת מדגם, הרכבה מדגם ושתקה של דגימות. בנוסף, יש לשמור על הדגימות מספר שעות לאחר הניתוח מבלי להתפשר על תפקוד ופעילות התא. בעוד שיש לנו אופטימיזציה התנאים עבור הדמיה ברזולוציה סופר חי במיוחד בתאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs) ותאי נבט אבות ברקמת האשכים ניתחו, טכניקה זו חלה באופן כללי על מגוון סוגי תאים שונים. היכולת להתבונן בתאים בתנאים הפיזיולוגיים שלהם מבלי להקריב רזולוציה מרחבית או זמנית תשמש ככלי רב ערך לחוקרים המבקשים לטפל בשאלות מכריעות בביולוגיה של התא.
Introduction
הדמיית מבנים תת-תאיים ודינמיקת חלבונים בתאים חיים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה של האור היא בדרך כלל מאתגרת מאוד1-3. בעוד טכניקות סופר-רזולוציה מרובות כגון סטוכוסטיק-אופטי-שחזור-מיקרוסקופיה (STORM), פוטו-מופעל-לוקליזציה-מיקרוסקופיה (PALM) ו-Stimulated-Emission-דלדול (STED)4,5,6 מיקרוסקופיה פותחו, סיבוכים בהכנת הדגימה כמו גם הצורך לשמור על כדאיות ופעילות ex vivo, להגביל את השימוש במיקרוסקופיה סופר-רזולוציה קונבנציונלית עבור דגימות חיות הדמיה. מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית אינה יכולה להגיע לרזולוציה מרחבית מעבר לרזולוציית XY של ~ 230 ננומטר ולעתים קרובות אינה מספיקה כדי לצפות במת-מבנים תאיים מורכבים5,6. עם זאת, פיתוח לאחרונה במיקרוסקופיה קונפוקלית, הדמיה סופר-רזולוציית Airyscan, הוא מסוגל להשיג כ 140 ננומטר (XY-רזולוציה)7,8 ויש לו הכנת מדגם פשוטה יחסית התואמת הדמיה חיה. מאז מערכת זיהוי הדמיה זו דורשת זמן רכישה ארוך, הרזולוציה המרחבית הגבוהה שלה באה במחיר של רזולוציה זמנית9. לכן, דרושה שיטה כדי להבטיח כי הדמיית תאים חיים מורחבת עם רזולוציה מרחבית גבוהה.
כאן, פיתחנו שיטה להתבוננות בתאים חיים ברקמה שלמה ברזולוציה האופטימלית שלה לפענוח מבנים תת-תאיים עם מידע מרחבי מפורט. שיטה זו מתוכננת כך שניתן להרכיב דגימות ביציבות במשך תקופה ארוכה של זמן (~ 10 שעות) מבלי לזוז או להתנוון. המדיה התאית החיה המשמשת בטכניקה זו יכולה לתמוך בתפקוד התאי ולהימנע מהלבנת תמונות עד 10 שעות תחת מיקרוסקופ ברזולוציה סופר. לבסוף, פרוטוקול זה ממזער את רוב הלחצים הנגרמים על ידי תאורה מתמדת של לייזרים על פני פרקי זמן ממושכים כגון היפוקסיה, שינויים בלחות וטמפרטורה, כמו גם תשישות תזונתית.
באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין תאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs), הצלחנו לראות כיצד הפעילות האסימטרית של microtubules מאפשר אינטראקציה מועדפת עם כרומטידים אחות ייחודית אפיגנטית10,11,12,13. סוגים אלה של אירועים תאיים הם דינמיים מאוד וקשה מאוד לדמיין אותם בתאים חיים באמצעות שיטות הדמיה אחרות ברזולוציית-על כגון STORM, PALM או STED. אנו צופים כי שיטה זו תהפוך שימושית מאוד עבור ביולוגים תא כפי שהם שואפים להבין את המבנים התת-תאיים הדינמיים של תאים חיים המתגוררים ברקמות. ישנם תחומים רבים שבהם ניתן ליישם שיטה זו, כגון לימוד הדינמיקה של חלבונים; הבנת תנועת התאים; ותהליכי מעקב אחר שושלת שושלתיים ובידול סלולרי, בין יישומים אפשריים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר לספק רזולוציה מרחבית גבוה ככל 10s של ננומטר4,5,6. שיטות המיקרוסקופיה STORM ו- PALM מאפשרות רזולוציה של עד 20 עד 50 ננומטר (רזולוציית XY), בעוד שמיקרוסקופיית STED מציעה רזולוציה של 20 עד 100 ננומטר (רזולוציית XY). הרזולוציה ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למתקן הליבה המשולבת של הדמיה באוניברסיטת ג’ונס הופקינס על מיקרוסקופים ותוכנות לניתוח נתונים. אנו מודים לג’יי סנדקר ול-Q. E. Yu על הגהה והצעות, ולחברי המעבדה של X.C על דיונים והצעות מועילים. נתמך על ידי NIGMS / NIH R35GM127075, המכון הרפואי הווארד יוז, קרן דוד ולוסיל פקרד, וקרנות ההפעלה של אוניברסיטת ג’ונס הופקינס (X.C.).
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
References
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
