マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定
Summary
ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。
Abstract
広範な研究は、二次リンパ器官におけるマウスB細胞の発達および分化を特徴付けている。B細胞によって分泌される抗体は、単離され、確立された治療薬へと発展してきた。マウスB細胞の発達の検証は、自己免疫性の多いマウスの文脈において、または免疫系を改変したマウスにおいて、マウスにおける治療薬の開発または試験の重要な構成要素であり、フローサイトメトリーの適切な使用である。十分に確立されたB細胞フローサイトメトリックパラメータは、マウス腹膜、骨髄、脾臓におけるB細胞の発達を評価するために使用できますが、多くのベストプラクティスを遵守する必要があります。さらに、B細胞区画のフローサイトメトリクス分析もB細胞開発の追加の読み出しを補完すべきである。この技術を用いて生成されたデータは、野生型、自己免疫しやすいマウスモデル、ならびに治療薬として抗体または抗体様分子を生成するために使用できるヒト化マウスの理解をさらに深めることができます。
Introduction
モノクローナル抗体は、主流の医学の一部となるにつれて、多くのヒト疾患の選択療法となっています 1,2.我々は、マウスIgH定数3,4を有する完全ヒト可変領域を有する抗体を効率的に産生する遺伝子操作マウスについて以前に説明した。最近では、明確な抗原結合を有する抗体様分子を産生する遺伝子操作マウスについて説明した。抗体はB細胞によって分泌され、体液性免疫の適応の基礎を形成する。B細胞にはB-1とB-2の2つの異なるタイプがあります。哺乳類では、B-1細胞は胎児肝臓に由来し、生後に粘膜組織および胸膜および腹腔に富み、B-2細胞は出生前に胎児肝臓に由来し、その後骨髄(BM)で生まれる。B-2細胞は、脾臓および血液を含む二次リンパ器官で濃縮される6,7,8.BMにおいて、B-2造血前駆物質は、Ig mu重鎖の再配列の開始時にプロB細胞に分化し始める9,10。Ig重鎖のプレB細胞受容体への組み立て(プレBCR)への組み換えが成功し、シグナル伝達および増殖増殖が、B細胞前細胞への分化をもたらす。プレB細胞がIg κ(Igκ)を再配置した後、または非生産的な場合、Igλ(Igλ)軽鎖は、μ重鎖と組み合わせ、表面IgM BCR発現をもたらす。IgM表面発現は自己反応性の条件下で低下することが知られており、機能的に無反応または無値B細胞11,12の自己耐性に寄与することが重要である。その後、未熟なB細胞は過渡期に入り、そこでIgDを共同発現させ、BMから脾臓に移行します。脾臓では、IgD発現がさらに増加し、細胞は移行B細胞の第2段階に成熟し、その後、その成熟状態が完了し、限界領域(MZ)または濾胞(Fol)細胞13、14、15のいずれかに発達する。成体マウスでは、非疾患の設定では、成熟したB細胞の数は、BMで毎日10〜2000万個の未熟なB細胞が生成されているにもかかわらず一定のままである。これらのうち、成熟B細胞のプールに入るのはわずか3%である。末梢B細胞区画のサイズは、自己反応性および不完全な成熟を含むいくつかの要因による細胞死によって制約される16、17、18。フローサイトメトリック解析は、ヒトおよびマウスにおける多くの免疫細胞サブコンパートメントを特徴付け、列挙するために広く使用されてきた。ヒトとマウスB細胞コンパートメントには類似点がいくつかありますが、このプロトコルはマウスB細胞の分析にのみ適用されます。このプロトコルは、遺伝子操作がB細胞の発達を変えるかどうかを判断するために、遺伝子操作されたマウスのフェノタイピングを目的に開発された。フローサイトメトリーは、細胞の活性化、機能、増殖、サイクル分析、DNA含有量分析、アポトーシス、細胞分類19,20など、多くの追加用途でも非常に人気があります。
フローサイトメトリーは、脾臓、BMおよび血液などの複雑な器官を含むマウスおよびヒトにおける様々なリンパ球コンパートメントを特徴付ける選択のツールである。フローサイトメトリー用のマウス特異的抗体試薬が広く利用可能なため、細胞表面タンパク質だけでなく、細胞内リンタンパク質やサイトカイン、機能読み出し21も調べることができます。ここで我々は、フローサイトメトリー試薬が、二次リンパ器官において成熟し、分化するB細胞サブセットを同定するためにどのように使用できるかを示す。染色条件の最適化、サンプル処理、正しい計測器のセットアップおよびデータ取得、そして最後にデータ分析の後、マウスにおけるB細胞区画の包括的なフローサイトメトリック分析用のプロトコルを利用することができる。このような包括的な分析は、ハーディと同僚によって考案された数十年前の命名法に基づいており、B220、CD43、BP-1、CD24、IgMおよびIgD22の発現に応じて、BM B-2細胞の開発を異なる画分(画分)に分割することができる。Hardy et al.は、B220+ CD43 BM B細胞がBP-1およびCD24(30F1)発現に基づいて4つのサブセット(フラクションA-C’)に細分化され得ることを示し、B220+ CD43-(薄暗い暗い)BM B細胞はIgDおよびIg3の微分発現に基づいて3つのサブセット(分画D-F)に分解できることを示した。分数A(プレプロB細胞)はBP-1-CD24(30F1)と定義され、フラクションB(初期のプロB細胞)はBP-1-CD24(30F1)+と定義され、フラクションC(後期プロB細胞)はBP-1+CD24(30F1)+と定義され、フラクションCはBP-1+として定義される(前B細胞)はBP-1+として定義される。さらに、分画D(前B細胞)はB220+ CD43-IgM-B細胞と定義され、画分E(新たに生成されたB細胞、未熟および過渡的の組み合わせ)はB220+ CD43-IgM+B細胞と定義され、画分F(成熟、再循環B細胞)と定義される。対照的に、脾臓に見られるナイーブB細胞の大部分は、成熟(B220+CD93–)B細胞と移行(T1、T2、T3)細胞に分けることができるCD93、CD23およびIgMの発現に依存する。成熟B細胞は、IgMおよびCD21/CD35の発現に基づいて、限界領域および濾胞サブセットに分解することができ、濾胞サブセットは、それらのIgMおよびIgD表面発現のレベルに応じて、成熟濾胞型Iおよび濾胞タイプIIB細胞サブセットにさらに分割することができる。これらの脾細胞B細胞集団は主にIgκ軽鎖を発現する。最後に、B-1 B細胞集団は、胎児の肝臓に由来し、主に成体マウスの腹膜および胸膜腔に見られるが、文献に記載されている。これらの腹膜B細胞は、CD23発現の欠如によって先述したB-2B細胞と区別することができる。その後、B-1aまたはB-1b集団にさらに細分化され、前者はCD5の存在によって定義され、後者は不在25によって定義される。B-1細胞前駆細胞は胎児の肝臓に豊富であるが、成人のBMには見られません。B-1aおよびB-1b細胞は異なる前駆細胞に由来するが、両方とも腹膜腔と胸膜腔24を播種する。B-2細胞とは対照的に、B-1細胞は自己再生が可能であり、天然IgM抗体の産生を担っています。
B細胞の発達における欠陥は、BCR26,27の成分の欠陥、BCRシグナル伝達強度に影響を与えるシグナル伝達分子の摂動14,28,29、またはB細胞生存を調節するサイトカインの破壊を含む多くの例で生じる可能性がある30,31.リンパ区画のフローサイトメトリー解析は、これらのマウスおよび他の多くのB細胞の発生ブロックの特性評価に寄与している。リンパ区画のフローサイトメトリック解析の利点の1つは、生きた解離組織から得られた個々の細胞に対して測定を行う能力を提供することです。拡大し続ける蛍光HOREの範囲で試薬が利用できることにより、複数のパラメータを同時に分析することができ、B細胞の不均一性の評価が可能になります。さらに、フロー細胞量分析によるB細胞の列挙は、リンパ器官内の細胞局在化を可視化する免疫組織化学法、液体免疫の尺度としての循環抗体レベルの検出、ならびに2つの光子顕微鏡をリアルタイムおよびtime32で測定する他の免疫学的アッセイを補完する。
Protocol
Representative Results
Discussion
リンパ球組織と非リンパ組織のフローサイトメトリック解析により、1980年代以降、マウスとヒトにおけるB細胞サブ集団の同時同定と列挙が可能になった。これは、液性免疫の尺度として使用されており、さらにB細胞の機能性を評価するために適用することができます。この方法は、試薬の可用性を利用して、マウスおよびヒトにおけるB細胞成熟の異なる段階を評価し、複数のパラメータを…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を批判的に読んでくださったマシュー・スリーマンに感謝します。また、この研究を支援してくれたRegeneronのビバリウム・オペレーション部門とフローサイトメトリーコア部門に感謝します。
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
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