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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

小鼠B细胞发育的流式细胞学表征

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61565
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

我们在这里描述了通过流式细胞术对腹膜，脾脏和骨髓组织中小鼠免疫B细胞室异质性的简单分析。该协议可以适应并扩展到其他小鼠组织。

Abstract

广泛的研究已经表征了鼠B细胞在继发性淋巴器官中的发育和分化。B细胞分泌的抗体已被分离出来，并发展成为成熟的治疗方法。在自身免疫易发小鼠或具有修饰免疫系统的小鼠中，小鼠B细胞发育的验证是在小鼠中开发或测试治疗剂的关键组成部分，并且是流式细胞术的适当使用。完善的B细胞流式细胞术参数可用于评估小鼠腹膜，骨髓和脾脏中的B细胞发育，但必须遵守许多最佳实践。此外，B细胞区室的流式细胞术分析也应该补充B细胞发育的额外读数。使用该技术生成的数据可以进一步了解野生型，自身免疫易发小鼠模型以及可用于产生抗体或抗体样分子作为治疗的人源化小鼠。

Introduction

单克隆抗体日益成为许多人类疾病的首选疗法，因为它们已成为主流医学的一部分1，2。我们之前已经描述了基因工程小鼠，其有效地产生具有小鼠IgH常数的完全人类可变区域的抗体3，4。最近，我们描述了基因工程小鼠，它们产生具有独特抗原结合的抗体样分子5。抗体由B细胞分泌，形成适应性体液免疫的基础。有两种不同类型的B细胞，B-1和B-2。在哺乳动物中，B-1细胞起源于胎儿肝脏，出生后富集于粘膜组织以及胸膜和腹膜腔，而B-2细胞在出生前起源于胎儿肝脏，此后起源于骨髓（BM）。B-2细胞富集于继发性淋巴器官，包括脾脏和血液6，7，8。在BM中，B-2造血祖细胞在Ig mu重链重排开始时开始分化为前B细胞9，10。Ig重链的成功重排及其组装到前B细胞受体（前BCR）中，以及信号传导和增殖扩增，导致分化为前B细胞。在B前细胞重新排列其Ig kappa（Igκ）之后，或者如果无效，则Ig lambda（Igλ）轻链，它们与μ重链配对，导致表面IgM BCR表达。重要的是要指出，已知IgM表面表达在自身反应性条件下降低，从而有助于功能无反应或无能B细胞的自耐受性11，12。未成熟的B细胞随后进入过渡阶段，在那里它们开始共表达IgD并从BM迁移到脾脏。在脾脏中，IgD表达进一步增加，细胞成熟为过渡B细胞的第二阶段，随后完成其成熟状态并发育为边缘区（MZ）或滤泡（Fol）细胞13，14，15。在成年小鼠中，在非疾病环境中，尽管BM中每天产生1000-2000万个未成熟的B细胞，但成熟B细胞的数量保持不变。其中，只有百分之三进入成熟B细胞池。外周B细胞室的大小受到细胞死亡的限制，部分原因是几个因素，包括自我反应性和不完全成熟16，17，18。流式细胞术分析已被广泛用于表征和枚举人类和小鼠中的许多免疫细胞亚区室。虽然人类和小鼠B细胞区室之间存在一些相似之处，但该协议仅适用于小鼠B细胞的分析。该协议的开发目的是对基因工程小鼠进行表型分析，以确定遗传操作是否会改变B细胞发育。流式细胞术在许多其他应用中也非常受欢迎，包括测量细胞活化，功能，增殖，循环分析，DNA含量分析，凋亡和细胞分选 19，20。

流式细胞术是表征小鼠和人类各种淋巴细胞区室的首选工具，包括脾脏，BM和血液等复杂器官。由于广泛用于流式细胞术的小鼠特异性抗体试剂，该技术不仅可用于研究细胞表面蛋白，还可用于研究细胞内磷酸蛋白和细胞因子，以及功能读数21。在这里，我们展示了流式细胞术试剂如何用于鉴定B细胞亚群，因为它们在继发性淋巴器官中成熟和分化。在优化染色条件，样品处理，正确的仪器设置和数据采集以及最终的数据分析之后，可以利用小鼠B细胞区室的综合流式细胞术分析方案。这种全面的分析基于Hardy及其同事设计的数十年前的命名法，其中发育的BM B-2细胞可以根据其表达的B220，CD43，BP-1，CD24，IgM和IgD22分为不同的组分（部分）。Hardy等人表明，B220+ CD43 BM B细胞可以基于BP-1和CD24（30F1）表达细分为四个亚群（分数A-C'），而B220 + CD43-（暗度至负）BM B细胞可以基于IgD和表面IgM23的差异表达分为三个子集（分数D-F）。A组分（前B细胞）定义为BP-1-CD24（30F1）-，B组分（早期前B细胞）定义为BP-1-CD24（30F1）+，C组（晚期前B细胞）定义为BP-1+ CD24（30F1）+，C级（早期前B细胞）定义为BP-1+和CD24high。此外，D组（前B细胞）被定义为B220 + CD43- IgM- B细胞，而E级（新生成的B细胞，未成熟和过渡的组合）被定义为B220 + CD43- IgM + B细胞，部分F（成熟，再循环B细胞）被定义为B220high CD43- IgM + B细胞。 相比之下，根据CD93，CD23和IgM的表达，在脾脏中发现的大多数幼稚B细胞可分为成熟（B220 + CD93-）B细胞和过渡（T1，T2，T3）细胞。成熟的B细胞可以根据IgM和CD21 / CD35的表达分解为边缘区和卵泡亚群，并且根据其IgM和IgD表面表达水平，卵泡亚群可以进一步分为成熟的滤泡I型和卵泡II型B细胞亚群24。这些脾B细胞群主要表达Igκ轻链。最后，文献中描述了起源于胎儿肝脏并主要存在于成年小鼠腹膜和胸膜腔中的B-1 B细胞群。这些腹膜B细胞可以通过缺乏CD23表达来与先前描述的B-2 B细胞区分开来。然后，它们被进一步细分为B-1a或B-1b种群，前者由CD5的存在定义，后者由其不存在来定义25。B-1细胞祖细胞在胎儿肝脏中丰富，但在成人BM中未发现。虽然B-1a和B-1b细胞来自不同的祖细胞，但它们都接种腹膜和胸膜腔24。与B-2细胞相比，B-1细胞具有独特的自我更新能力，并负责产生天然IgM抗体。

在许多情况下，B细胞发育中的缺陷可能会出现，包括BCR26，27成分的缺陷，影响BCR信号传导强度的信号分子的扰动14，28，29，或调节B细胞存活的细胞因子的破坏30，31.淋巴管室的流式细胞术分析有助于表征这些小鼠和许多其他小鼠中的B细胞发育块。淋巴管室流式细胞术分析的一个优点是，它能够对从活解离组织获得的单个细胞进行测量。在不断扩大的荧光团范围内，试剂的可用性允许同时分析多个参数，并能够评估B细胞异质性。此外，通过流式细胞术分析枚举B细胞补充了其他免疫学测定，例如免疫组织化学方法，可视化淋巴器官内的细胞定位，检测循环抗体水平作为体液免疫的衡量标准，以及两个光子显微镜来测量B细胞在真实空间和时间上的反应32。

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Protocol

所有小鼠研究均由Regeneron的机构动物护理和使用委员会（IACUC）监督和批准。该实验是在杰克逊实验室的三只C57BL / 6J雌性小鼠（17周龄）的组织上进行的。在开始实验之前滴定所有抗体以确定理想浓度。使用补偿珠进行单色补偿时，请确保它们比样品更亮或更亮。将所有缓冲液，抗体和细胞保存在冰上或4°C。 加入活性染料后，在4°C的低光或黑暗中进行所有步骤和孵育。

1. 腹膜细胞采集和单细胞分离

  1. 使用CO2 或根据批准的协议对小鼠实施安乐死。
  2. 将鼠标放在背部，喷洒70%乙醇，并用剪刀切开外腹部皮肤，小心不要切开腹膜。
  3. 将 3 mL 冰冷洗涤缓冲液（0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 DPBS 中 [vol/vol]）注入腹膜腔，用装有 25 号针头的 3 mL 注射器。
  4. 用指尖轻轻按摩腹膜。
  5. 重复步骤 1.3 和 1.4。
  6. 将装有18 G针头的3 mL注射器插入腹膜，小心避免器官和脂肪。
  7. 提取现在含有腹膜细胞的洗涤缓冲液，并转移到冰上的15mL锥形管中。
  8. 重复步骤 1.3 和 1.4。
  9. 在腹膜上切一个小孔，同时用镊子镊子支撑。
  10. 将一次性转印移液管插入孔中并收集剩余的洗涤缓冲液，再次避免脂肪和器官。
  11. 将收集的剩余腹膜细胞转移到冰上的15mL锥形管中。
    注意：如果血液污染明显，请丢弃样品。
  12. 将细胞在冰上孵育，直到脾脏和骨提取完成。
  13. 在4°C下以300× g 离心细胞8分钟。吸出上清液。
  14. 将细胞沉淀重悬于1mL洗涤缓冲液中。
  15. 通过70μM细胞过滤器将细胞过滤到冰上干净的15 mL锥形管中。
  16. 使用细胞计数器仪器或血细胞计数器测定细胞浓度。

2. 脾脏采集和单细胞分离

  1. 将鼠标放在腹部，用干净的剪刀切开左背部的腹膜。切除脾脏，去除脂肪和结缔组织。
  2. 将脾脏转移到含有1 mL冰上洗涤缓冲液的1.5mL微量离心管中。
  3. 将脾脏在冰上孵育，直到骨提取完成。
  4. 将脾脏移至装有5 mL红细胞裂解缓冲液的自动解离管。将管子放在组织解离器上并解离60秒以产生单个细胞悬浮液。
    注意：也允许使用其他常规方法获得单细胞脾脏悬浮液，例如在洗涤缓冲液中的磨砂载玻片之间粉碎。如果使用另一种解离方法，则在解离后进行离心，抽吸，然后在5mL红细胞裂解缓冲液中重悬，然后继续步骤2.5。
  5. 将细胞在室温下孵育3分钟。
  6. 加入10 mL含有2mM EDTA的4°C洗涤缓冲液。
  7. 转移到干净的15 mL锥形管中。
  8. 在4°C下以300× g 离心细胞8分钟。 吸出上清液。
  9. 将细胞沉淀重悬于5mL的4°C洗涤缓冲液中。
  10. 通过70μM细胞过滤器将细胞过滤到冰上干净的15 mL锥形管中。
  11. 使用细胞计数器仪器或血细胞计数器测定细胞浓度。

3. BM收获和单细胞分离

  1. 从小鼠身体的下半部分去除皮肤。修剪腿部多余的肌肉。用剪刀切除整条腿，小心不要割伤股骨。通过去除剩余的肌肉，脂肪和脚来清洁股骨和胫骨。
  2. 将骨头转移到含有1 mL冰上洗涤缓冲液的1.5 mL微量离心管中。
  3. 将0.5 mL微量离心管的底部穿孔，留下一个足够小的孔，使腿骨不会突出。将0.5 mL离心管插入干净的1.5 mL微量离心管中。剪掉股骨和胫骨近端到膝盖的末端，并将切口末端朝下放入0.5 mL管中。
  4. 在4°C下以6，780× g 离心细胞2分钟。
  5. 将细胞沉淀重悬于1mL红细胞裂解缓冲液中，并转移到含有额外3mL红细胞裂解缓冲液的15mL锥形管中。
  6. 在室温下孵育3分钟。
  7. 加入10 mL含有2mM EDTA的4°C洗涤缓冲液。
  8. 在4°C下以300× g 离心细胞8分钟。 吸出上清液。
  9. 将细胞沉淀重悬于3mL的4°C洗涤缓冲液中。
  10. 通过70μM细胞过滤器过滤细胞到冰上干净的15 mL锥形管中。
  11. 使用细胞计数器仪器或血细胞计数器测定细胞浓度。

4. 染色细胞并准备补偿

  1. 将来自每只动物的每种细胞类型的106 个细胞等分到96孔U底板中。
    1. 确保为所有样品和对照包括足够的孔，包括全染色，荧光减一（FMO），未染色，最后对所使用的每个荧光团进行可选的单色补偿。
    2. 对于BM成熟面板和脾脏成熟面板，将细胞等分到2孔中，每孔106 个细胞，用于每个完整的染色样品。对于单色补偿活力对照，将每种细胞类型的2×106 个细胞添加到单个孔中。
  2. 在4°C下以845× g 离心板2分钟。 通过快速倒置并在水槽上轻拂板来倾倒上清液，注意不要交叉污染孔。
  3. 将细胞重悬于200μL DPBS（不含BSA或FBS）中。该步骤对于在用胺反应活性染料染色之前除去蛋白质非常重要。
  4. 重复步骤 4.2 和 4.3。
  5. 重复步骤 4.2。
  6. 将细胞重悬于100μL活性染料中，以1：1，000稀释在DPBS中。
    注意：如果使用细胞进行单色补偿，请不要向这些孔中添加活性染料。
    1. 对于每个染色剂组，留出几个未染色的孔，用于完全未染色的样品和您可能需要的任何其他对照。
    2. 对于每个染色剂组，留出一个额外的未染色孔，用于可行性FMO控制。
    3. 对于单色活力补偿对照：将2×10 6 个细胞重悬于步骤4.1中等分，放入200μL稀释的活力染料中。将100μL细胞转移到1.5mL微量离心管中，在65°C下加热细胞5分钟，然后将100μL热杀细胞与100μL剩余活细胞一起转移回原始孔中。
  7. 将细胞在4°C下孵育，避光，30分钟。
  8. 在4°C下以845× g 离心板2分钟。 通过快速倒置并在水槽上轻拂板来倾倒上清液，注意不要交叉污染孔。
  9. 将细胞重悬于200μL DPBS（不含BSA或FBS）中。
  10. 重复步骤 4.8 和 4.9。
  11. 重复步骤 4.8。
  12. 将细胞重悬于染色缓冲液中以1：50（终浓度= 10μg/ mL）稀释的50μLFc块中（DPBS中0.5%BSA [vol / vol]）。
    1. 对于腹膜细胞 - 还加入5μL单核细胞阻滞剂以减少非特异性染色。
  13. 将细胞在4°C下孵育，避光，15分钟。
  14. 在染色缓冲液中制备完整的染色剂预混液和FMO，最终体积为每106 个细胞100μl。抗体列表见 表1-表4 。
    注意：FMO是通过将除一种抗体以外的所有抗体包含在染色剂集中而制成的。为染色剂组中的每种抗体准备FMO。当染色剂套装包含多种明亮染料时，用每个样品用50 μL明亮染色缓冲液代替染色缓冲液
  15. 在不去除Fc块的情况下，将100μL全染色混合物和FMO加入选定的孔中。
  16. 为染色剂集中的每种抗体准备单色补偿对照。
    1. 如果使用补偿珠，请遵循制造商的使用说明。
    2. 如果使用细胞，将滴定的抗体加入100μL染色缓冲液中，将先前在步骤4.6.1中保留的没有活性染料的106 个细胞中。如果样品中的所有细胞均为特定标记物阳性，则在流式细胞仪上获取补偿数据时，留出未染色的细胞使用。
  17. 将细胞和微球在4°C下孵育，避光，30分钟。
  18. 在4°C下以845× g 离心板2分钟。 通过快速倒置并在水槽上轻拂板来倾倒上清液，注意不要交叉污染孔。
  19. 将细胞和磁珠重悬于200μL染色缓冲液中。
  20. 重复步骤 4.18 和 4.19 两次。
  21. 重复步骤 4.18。
  22. 为了在48小时内固定样品进行分析，将细胞和磁珠重悬于DPBS中的200μL2%多聚甲醛中。
    注意：副焦醛对健康有严重危害，易燃。使用前请参考安全数据表。
  23. 将细胞和微球在4°C下孵育，避光，30分钟。
  24. 重复步骤 4.18 和 4.19 两次。
  25. 将滤板放在干净的96孔U底板上。使用多管移液器，将每个样品转移到过滤板的孔中。
  26. 在4°C下以845× g 离心滤板-96孔U型底板设置2分钟。 取出滤板，通过快速倒置并在水槽上轻拂板来倾倒上清液，注意不要交叉污染孔。
  27. 对于BM和脾脏成熟面板，将完全染色的细胞重悬于100μL染色缓冲液中。将每只动物的2个孔混合成1个孔。将剩余的样品板、FMO和对照品重悬于200 μL染色缓冲液中。
  28. 在4°C下孵育固定细胞和微珠，避光，过夜。

5. 流式细胞仪数据采集

  1. 根据制造商的说明初始化和质量控制流式细胞仪。
  2. 加载特定于每个面板的模板。
  3. 在记录数据之前，请确保每个样本的所有事件都按比例排列并在点阵图上可见。
  4. 使用步骤4.16中准备的单一污渍补偿记录每个污渍面板的补偿控制。为每个样本设置正极和负极门。让软件计算补偿矩阵。
  5. 开始获取第一个样品，并确保正确设置了门。
  6. 将机器设置为记录腹膜B细胞面板和脾脏Igκ和Igλ面板的至少50，000个B细胞事件;BM成熟面板的150，000 B细胞事件;和300，000个B细胞事件用于脾脏成熟面板。
  7. 对于每个染色面板，运行并记录每只动物，未染色样品和FMO的完全染色样品。

6. 分析数据

  1. 使用流式细胞术分析软件继续进行数据分析。遵循图 1、图 2、图 3 和图 4 中概述的门控策略。 

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Representative Results

在这里，我们提出了表征小鼠腹膜，BM和脾脏中B细胞发育的门控策略。分析的基础是围绕用活性染料染色的概念形成的，然后根据前向散射区域（FSC-A）和正向散射高度（FSC-H）门控双峰，最后通过根据其FSC-A和侧散射面积（SSC-A）特征选择细胞来门控碎片，这里称为尺寸门，它们反映了相对细胞大小和细胞粒度， 在对感兴趣的人群进行门控之前。

使用表1中概述的染色面板，对腹膜B细胞进行流式细胞术分析显示了C57BL / 6J小鼠中活的腹膜细胞，总B细胞，B-1和B-2亚群以及B-1a和B-1b细胞的频率（图1）。这些频率的平均绝对小区数示于表5中。B-1细胞中的扰动可以通过细胞亚群的分布来描绘，无论是细胞频率还是每只小鼠的绝对细胞数。

BM B细胞的流式细胞术分析使用表2中概述的染色面板显示C57BL / 6J小鼠中活BM细胞，总B细胞，A级（前前B细胞和污染淋巴细胞），前B分，C级，C'级，D级，未成熟（E级分中的亚群），过渡（E级分中的亚群）和F级B细胞（图2）的频率。这些频率的平均绝对像元数示于表6中。B型细胞中的扰动可以通过细胞亚群的分布来描绘，无论是细胞频率还是每条腿的绝对细胞数。

对脾B细胞的流式细胞术分析使用表3中概述的染色面板显示C57BL / 6J小鼠中活脾细胞，总B细胞，过渡B细胞，T1，T2，T3细胞，成熟B细胞，滤泡I细胞（Fol I），滤泡II（Fol II）细胞，边缘（MZ）前体细胞，成熟MZ细胞和B-1细胞的频率（图3）。这些频率的平均绝对像元数示于表7中。脾B细胞中的扰动可以通过细胞亚群的分布来描绘，无论是细胞频率还是每个脾脏的绝对细胞数。

同样，使用表4中概述的染色面板，对脾脏进行流式细胞术分析显示了C57BL / 6J小鼠中Igκ +和Igλ + B细胞的频率（图4）。这些频率的平均绝对像元数示于表8中。Igκ+和Igλ+Bcells中的扰动可以通过细胞亚群的分布来描绘，无论是细胞频率还是每个脾脏的绝对细胞数。

抗体 荧光基团 克隆
光盘19 阿卡-H7 1D3
抗氧化剂 B220 阿卡 RA3-6B2
断续器 PeCy7 二/41
断续器 每氯乙烯5.5 11-26c.2a
CD43 菲克 S7型
二氧化硫 宝马395 B3B4
CD11b BV711 M1/70型
光盘 5 BV605系列 53-7.3

表1：腹膜B细胞组

抗体 荧光基团 克隆
光盘19 阿卡-H7 1D3
抗氧化剂 B220 阿卡 RA3-6B2
断续器 PeCy7 二/41
断续器 每氯乙烯5.5 11-26c.2a
CD43 菲克 1B11
CD24 （HSA） 体育 30-F1
C 套件 宝马395 2B8
血压-1 BV786 血压-1
光盘93 BV711 AA4.1
转储通道
光盘3 AF700系列 17-A2
CD11b AF700系列 M1/70型
GR1 （Ly6C/6G） AF700系列 RB6-8C5
Ter119 AF700系列 三-119

表2：骨髓成熟面板

抗体 荧光基团 克隆
光盘19 阿卡-H7 1D3
抗氧化剂 B220 阿卡 RA3-6B2
断续器 PeCy7 二/41
断续器 每氯乙烯5.5 11-26c.2a
CD43 菲克 S7型
二氧化硫 宝马395 B3B4
CD21/35 BV421系列 7G6
CD11b AF700系列 M1/70型
光盘 5 BV605系列 53-7.3
光盘93 体育 AA4.1

表3：脾脏成熟面板

抗体 荧光基团 克隆
光盘19 阿卡-H7 1D3
抗氧化剂 B220 阿卡 RA3-6B2
断续器 PeCy7 二/41
断续器 每氯乙烯5.5 11-26c.2a
光盘3 铅 17-A2
卡帕 菲克 187.1
Lambda 体育 RML-42

表4：脾脏Igκ和Igλ面板

Figure 1
图1：腹膜中B细胞群的表征。 通过对IgM +细胞进行门控，首先将活的，单细胞，大小的门控腹膜B细胞与污染细胞分离。然后通过不存在（B-1）或CD23（B-2）来区分B-1和B-2细胞。接下来，CD5表达用于从B-1b细胞（CD5-）中描绘B-1a细胞（CD5 +）。FMO被用来根据经验确定在哪里绘制门。数字是同一密度图中每个总体的百分比。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：BM中B细胞亚群的表征。通过在B220 +dump-（其中转储是指CD3 / GR-1 / CD11b / TER119）细胞上浇口，将活的，单细胞，大小的门控BM B细胞与非B细胞分离。CD43和B220表达进一步定义了耐寒分数A-C'（CD43 + B220+）和耐寒分数D-F（CD43low/neg B220 +/++）。馏分A-C'通过BP-1和CD24的表达进一步分离。A级（BP-1-CD24-）对应于前B前细胞以及污染细胞。 为了将前B前细胞与A级分中的污染细胞分离，利用CD93的表达和CD19的缺失。B级（BP-1-CD24int）和C级（BP-1 + CD24int）分别对应于早期和晚期的Pro-B细胞，而C级（BP-1 + / - CD24 +）对应于早期的前B细胞。为了分离馏分D-F，利用IgM和IgD的表达。D级对应晚期前B细胞（IgM-/低IgD-）;E级（蓝门，IgMint/高IgD-）到未成熟（Imm，IgMint IgD-）和过渡（Tran，IgMhigh IgD-）B细胞;和部分F（IgMint/高IgD +）再循环成熟的B细胞。FMO被用来根据经验确定在哪里绘制门。数字是同一密度图中每个总体的百分比。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：脾B细胞成熟的表征。活的，单细胞的，大小的门控脾B细胞通过对B220 +细胞进行门控，与非B细胞分离。为了鉴定B-1亚群，通过CD43的表达来鉴定和定义CD23-CD19 +细胞。为了对B-2群体进行分类，将CD19 +细胞分离为过渡（CD93 + B220 +）和成熟（CD93- B220 +）B细胞。过渡（CD93 + B220 +）细胞进一步分为T1（IgM + CD23-），T2（IgM + CD23 +）和T3（IgMint CD23 +）群体。将成熟（CD93-B220+）细胞分为边缘区（CD21/35+ IgM+）和滤泡（CD21/35int IgMint/+）B细胞。CD23的表达进一步用于从更成熟的MZ（CD23-B220 +）细胞中分离MZ前体（CD23 + B220 +）细胞。然后将滤泡群描绘为Fol I（IgD + IgMint）和Fol II（IgD + IgM +）细胞。FMO被用来根据经验确定在哪里绘制门。数字是同一密度图中每个人口的百分比 请单击此处查看此图的放大版本。

Figure 4
图4：脾B细胞的Igκ和Igλ表达。通过对B220 + CD3-细胞进行门控，将活的，单细胞，大小的门控脾B细胞与非B细胞分离。然后通过Igλ和Igκ的表达来区分B细胞。数字是同一密度图中每个总体的百分比。请点击此处查看此图的放大版本。

绝对单元格编号
动物编号 活的腹膜细胞 B 细胞 B-1a电池 B-1b细胞 B-2细胞
1 1.02E+07 4.67E+06 1.28E+06 8.95E+05 2.35E+06
2 9.92E+06 4.52E+06 1.49E+06 9.60E+05 1.91E+06
3 1.15E+07 4.56E+06 1.71E+06 9.19E+05 1.78E+06
平均 1.05E+07 4.58E+06 1.49E+06 9.25E+05 2.01E+06

表5：腹膜B细胞亚群的绝对细胞数

绝对单元格编号
动物编号 活骨髓细胞 B 细胞 分数 A 专业预科 分数 B 馏分 C C'级分 分数 D 幼稚 过渡 分数 F
1 5.05E+07 9.70中+06 1.13E+06 1.95E+05 2.22E+05 9.14E+04 6.31E+05 1.59E+06 4.56E+05 7.81E+05 4.03E+06
2 5.39E+07 1.03E+07 1.14E+06 2.29E+05 2.89E+05 1.22E+05 8.40中欧+05 2.11E+06 5.39E+05 8.07E+05 3.67E+06
3 5.93E+07 1.01E+07 1.10E+06 2.12E+05 2.84E+05 1.05E+05 9.02中+05 2.72E+06 5.94E+05 7.62E+05 2.59E+06
平均 5.46E+07 1.00E+07 1.12E+06 2.12E+05 2.65E+05 1.06E+05 7.91E+05 2.14E+06 5.29E+05 7.83E+05 3.43E+06

表6：骨髓B细胞亚群的绝对细胞数

绝对单元格编号
动物编号 活脾细胞 B 细胞 过渡B细胞 T1 细胞 T2 细胞 T3 细胞 成熟的B细胞 滤泡I细胞 滤泡II细胞 前体边缘区细胞 成熟的边缘区细胞 B-1细胞
1 9.16E+07 4.61E+07 3.66E+06 1.55E+06 1.10E+06 7.16E+05 4.06E+07 2.39E+07 5.27E+06 2.17E+06 3.98E+06 8.83E+05
2 9.97E+07 5.18E+07 4.88E+06 1.97E+06 1.57E+06 1.00中+06 4.49E+07 2.68E+07 7.33E+06 3.42E+06 3.84E+06 8.15E+05
3 1.02E+08 5.34E+07 4.64E+06 1.98E+06 1.41E+06 8.54E+05 4.62E+07 2.81E+07 5.84E+06 3.58E+06 4.02E+06 1.01E+06
平均 9.77E+07 5.04中+07 4.39E+06 1.83E+06 1.36E+06 8.58E+05 4.39E+07 2.63E+07 6.15E+06 3.06E+06 3.94E+06 9.02中+05

表7：脾B细胞亚群的绝对细胞数

绝对单元格编号
动物编号 活脾细胞 B 细胞 Igκ+ B 细胞 Igλ+ B 细胞
1 9.16E+07 4.97E+07 4.51E+07 2.46E+06
2 9.97E+07 5.63E+07 5.08E+07 3.16E+06
3 1.02E+08 5.91E+07 5.33E+07 3.24E+06
平均 9.77E+07 5.50E+07 4.97E+07 2.95E+06

表8：Igκ和Igλ B细胞亚群的绝对细胞数

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Discussion

自20世纪80年代以来，淋巴和非淋巴组织的流式细胞术分析使小鼠和人类中的B细胞亚群能够同时鉴定和枚举。它已被用作体液免疫的衡量标准，可以进一步用于评估B细胞功能。该方法利用试剂的可用性来评估小鼠和人类B细胞成熟的不同阶段，通过同时分析多个参数，即使在罕见的人群中也能评估B细胞异质性。如果用于测量复杂的异质性样品，它可以在几分钟内检测单个细胞上的亚群33。顺序门控分析策略最常应用于流式细胞术分析，当必须识别特定群体时，该策略可以简单直观地进行34。最后，流式细胞术的另一个优点是，在有经验的用户的指导下，它很容易适应大多数学术实验室。我们的方案通过描述和枚举B-1群体并深入研究B-2前B细胞，前B细胞，未成熟，过渡和成熟B细胞的表面表达，成功地描述了对小鼠腹膜，BM和脾脏中B细胞群的评估，以及它们对Igκ或Igλ轻链的表面表达。流式细胞术是研究小鼠B细胞发育时使用最广泛，最容易应用的方法。

虽然流式细胞术可以产生宝贵的数据，但当用于研究免疫B细胞室的异质性时，这项技术存在一些局限性。庞大的数据集可能令人不知所措，因为 10 种颜色染色可以识别超过 1，024 个不同的细胞群34。必须考虑到，一些常用的淋巴细胞标志物已被证明比最初想象的要少。这可以通过使用大量细胞表面标记物来确定所需群体的门控来解决。虽然流式细胞术分析可以简单直观，但流式细胞术分析的另一个限制是，它通常允许一次只可视化两个参数，尽管在使用高参数流式细胞术时，可以使用t-SNE等数据可视化工具更有效地聚类细胞群。另一个重要的限制是，在采集和分析过程中使用的门有时取决于操作员的主观性。

为了成功适应或复制该协议，必须考虑几个关键参数35。在面板设计和荧光染料选择时必须仔细考虑。必须将暗淡或重要的抗原与明亮的荧光染料配对。必须进行抗体滴定，以避免过量的抗体与细胞非特异性结合，从而可能增加背景染色并降低分辨率。抗体滴定是通过用抗体浓度降低染色已知数量的细胞来进行的，以确定最佳分离指数36。对于每批抗体，都应重复此操作。在样品制备和染色过程中，通过避免Ca ++ 和Mg ++来确保单细胞悬浮液非常重要。此外，添加EDTA可以帮助防止细胞聚集和酶活性，这可能导致抗体介导的标记物的化和内化。在数据采集之前，样品必须正确悬浮、过滤且无聚集体。信号从一个参数溢出到另一个参数可通过使用补偿控制装置（单个染色细胞或市售补偿微珠的形式）来解决35。另一个重要的考虑因素是在每个实验中进行适当的控制。未染色的细胞建立自发荧光的基线。由于非特异性绑定，同种型控件不再被视为用于门控的适当控件。帮助制造精确门的最重要步骤是使用FMO控制。在FMO对照中，除被控制的抗体外，所有偶联抗体都存在于染色剂中。FMO控制可以测量所有荧光团向缺失通道的扩散，从而允许相应地设置门。获得足够的细胞以提高准确性至关重要。根据经验，应至少收集2，000个感兴趣的人群事件。最后，补偿对照，无论是磁珠还是细胞，都应与正在使用的荧光染料完全匹配，并且对照必须至少与实验样品一样明亮37。

总体而言，B细胞区室的低细胞学分析在免疫学领域被广泛使用。该技术可用于研究野生型和转基因小鼠在非疾病状态下和免疫学挑战下体液免疫的扰动。

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Disclosures

所有作者都是Regeneron Pharmaceuticals， Inc.的员工和股东。

Acknowledgments

我们感谢马修·斯利曼（Matthew Sleeman）对手稿的批判性阅读。我们还感谢Regeneron的Vivarium运营和流式细胞术核心部门对这项研究的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes Eppendorf  22363611 0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes  Eppendorf  22364111 1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes  Corning  352097 15 mL conical tube
18 gauge needle BD 305196
25 gauge needle BD  305124
3 mL syringe BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer  Miltenyi Biotec  130-110-916  70 mM cell strainer
96 well U bottom plate  VWR 10861-564
ACK lysis buffer  GIBCO  A1049201 red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate Pall Corporation 8027 filter plate
B220 eBiosciences 17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ BD 552843 compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ BD 552844 compensation beads
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A8577 BSA
BP-1 BD 740882
Brilliant Stain Buffer BD 566349 brilliant stain buffer
C-Kit BD 564011
CD11b BD 563168
CD11b BioLegend 101222
CD19 BD 560143
CD21/35 BD 562756
CD23  BD 740216
CD24 (HSA) BioLegend 138504
CD3 BD 561388
CD3 BioLegend 100214
CD43 BD 553270
CD43 BioLegend 121206
CD5 BD 563194
CD93 BD 740750
CD93 BioLegend 136504
DPBS (1x) ThermoFisher 14190-144 DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 ThermoFisher 65-0866-14 viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette Samco 233 disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer BD custom order flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) BD 553142 Fc block
FlowJo Flowjo flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes  Miltenyi Biotec  130-096-334 automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters  Miltenyi Biotec  130-095-937 tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G) BioLegend 108422
IgD BioLegend 405710
IgM eBiosciences 25-5790-82
Kappa BD 550003
Lambda BioLegend 407308
paraformaldehyde, 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714
Ter119 BioLegend 116220
True-Stain Monocyte Blocker BioLegend 426103 monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575038 EDTA
Vi-CELL XR Beckman Coulter 731050 cell counter instrument 

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References

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免疫学和感染，第167期，B细胞，淋巴细胞，发育，分化，腹膜，骨髓，脾脏，流式细胞术，小鼠
小鼠B细胞发育的流式细胞学表征
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