Summary

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

Published: July 29, 2020
doi:

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

Abstract

טון עורקי כלילית יחד עם פתיחה או סגירה של נימים במידה רבה לקבוע את זרימת הדם cardiomyocytes בלחץ זלוף מתמיד. עם זאת, קשה לעקוב אחר השינויים הדינמיים של העורקים הכליליים ונימים בלב כולו, בעיקר בשל התנועה שלה פועם ללא הפסקה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת ניטור של קצב זלוף העורקים, לחץ ושינויים בקוטר של העורקים ונימים בשרירי הפפילרי הימניים של העכבר. עורק מחיצת העכבר הוא cannulated ו perfused בזרימה מתמדת או לחץ עם האחר נמדד באופן דינמי. לאחר זלוף עם לקטין שכותרתו פלואורסצנטית (למשל, אלקסה פלואור-488 או -633 שכותרתו חיטה-נבט Agglutinin, WGA), העורקים ונימים (וכלי דם אחרים) בשריר פפילרי החדר הימני מחיצה יכול להיות בתמונה בקלות. לאחר מכן ניתן למדוד את השינויים בקוטר כלי השיט בנוכחות או בהיעדר התכווצויות לב. כאשר חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית באו לידי ביטוי, ניתן היה לפקח על תכונות ספציפיות. לדוגמה, פריטיטים הוצגו בלבבות עכברים שהביעו NG2-DsRed. שיטה זו סיפקה פלטפורמה שימושית כדי ללמוד את הפונקציות הפיזיולוגיות של pericytes נימי בלב. הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של ריאגנטים על זרימת הדם בלב על ידי מדידת קוטר כלי הדם / נימי ואת הלחץ הזוהר העורקי בו זמנית. הכנה זו, בשילוב עם מערכת הדמיה אופטית מתקדמת, מאפשרת לחקור את זרימת הדם ואת שליטתה ברמה התאית והמולקולרית בלב בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

Introduction

תקנה מתאימה לזרימת לחץ כלילית מבטיחה אספקת דם מספקת ללב כדי לענות על דרישותיו המטבוליות1. עם זאת, רק לאחרונה התברר כיצד זרימת הלחץ הכלילי מוסדר באופן דינמי בלב, למרות מחקרים מקיפים שבוצעו ב vivo ו במבחנה בעשורים האחרונים. אחת הסיבות לכך היא הקושי להקים מודל עבודה פיזיולוגי למחקרים כאלה עקב פעימות הלב המתמידות. ללא קשר, הוקמו מגוון שיטות לתצפית על כלי הדם הכליליים ברקמות או בבעלי חיים חיים, אך אף אחת משיטות אלה לא הצליחה להשיג מיקוד קבוע /יציב ומדידות הלחץ, הזרימה וקוטר המיקרו-וסקולרי בו זמנית2,3. ההדמיה הישירה של כלי הדם העורקיים הכליליים בלב פועם הוצגה לפני עשרות שנים4,3, אבל מדידות הקוטר בכלי קטן היה מאתגר ואת הפונקציות הספציפיות של סוגי תאים מיוחדים רבים הקשורים microcirculation היה מרגיז באותה מידה. אפילו השיטה סטרובוסקופית ומערכת אובייקטיבית צפה לא יכול לספק את המידע לעיל בו זמנית5. עם זאת, כמות משמעותית של מידע בעל ערך הושגה באמצעות הטכנולוגיות הנ”ל, אשר עזרו לנו להבין יותר על הרגולציה של זרימת דם כלילית6. השיטה שאנו מתארים במאמר זה תסייע לאחת לחקור ולהבין בפירוט כיצד רכיבים של עורקים כליליים, העורקים והמיקרו-וסקולטורה מגיבים באופן שונה לגירויים ולדרישות מטבוליות.

מודל העבודה שהקמנו כדי להמשיך במחקרים אלה נבנה על העבודה הקודמת של ווסטרהוף ואח‘2. בעקבות קנולציה של עורק המחיצה של לב העכבר, תמיסת מלח פיזיולוגית שימשה כדי להחדיר את העורק כדי לשמור על myocytes ורכיבים אחרים של רקמת הלב ניזונו. לחץ הזלוף העורקי, הזרימה וקוטר כלי הדם היו במעקב בין פונקציות פיזיולוגיות אחרות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים מתאימים. שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין את מיטת המיקרו-כלילית תחת לחץ פיזיולוגי ברקמה חיה וללמוד לראשונה את המנגנונים התאיים שבבסיס ויסות המיקרו-סירקולציה.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת מרילנד בולטימור והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה פרוטוקולים. 1. הכנת הפתרונות הערה: הכינו פתרונות מראש. שני סוגים של פתרונות בסיסיים משמשים בניסויים: (1) פתרונות מלוחים פיזיולוגיים (PSS) עבור superfu…

Representative Results

כאשר סמן כלי דם פלואורסצנטי הוא perfused לומן כלי דם (כאן WGA מצומד עם Alexa Fluor-488), ניתן לדמיין עצי כלי דם שלמים כפי שמוצג באיור 5 (פאנל שמאלי) באמצעות מיקרוסקופ confocal במהירות גבוהה. הגדלה נוספת מאפשרת הדמיה של נימי בפירוט(איור 5, לוח ימני). מאז המערכת בלחץ תומך ניטור מת?…

Discussion

בעבודה הנוכחית, הצגנו שיטת אקס ויו פשוטה להפליא אך מעשית מאוד לחקר המיקרו-סירקולציה כלילית בלב בתנאים פיזיולוגיים. שיטה זו שונתה מחקירות מכניות באמצעות חולדות2. התוספת המאתגרת הייתה טכנולוגיית ההדמיה במהירות גבוהה וברזולוציה אופטית גבוהה. לכן, הצלחנו לנצל את מערכות ההדמיה ה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המרכז להנדסה וטכנולוגיה ביו-רפואית (BioMET); NIH (1U01HL1116321) ו -(1R01HL142290) ואיגוד הלב האמריקאי 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (בג”ץ).

Materials

1 M CaCl2 solution MilliporeSigma, USA 21115
1 M MgCl2 solution MilliporeSigma, USA M1028
AxoScope software Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator FisherScientific, USA Isotemp 3016S
Confocal Nikon Instruments, USA A1R
Custom glass tubing Drummond Scientific Company 9-000-3301
Digidata 1322A Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope Olympus, Japan SZX12
Endothelin-1 MilliporeSigma, USA E7764
Forceps Fine Scientific Tools 11295-51
Heparin Sodium Salt Sigma-Aldrich, USA H3393
Inline solution Heater Warner Istruments, Hamden, CT, USA SH-27B
Isoflurane VETone, Idaho, USA 502017
Micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97
Micropipette/cannula holder Warner Istruments, Hamden, CT, USA 64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse The Jackson Laboratory #008241
Nylon thread for tying blood vessels Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane) SYLGARD, Germantown, WI, USA 184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA minipuls 3
Pressure Servo Controller Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA PS-200-S
Scissors Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA 15000-10
Servo Pump Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA PS-200-P
Temperature controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA W11261

References

  1. Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
  2. Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
  3. Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
  4. Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
  5. Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
  6. Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
  7. Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
  8. Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
  9. Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
  10. Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
  11. Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
  12. Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).

Play Video

Cite This Article
Zhao, G., Joca, H. C., Lederer, W. J. Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart. J. Vis. Exp. (161), e61566, doi:10.3791/61566 (2020).

View Video