这里介绍的是一个协议,通过前体监测维持压力的动脉灌注压力和流量,以及血管树成分,包括毛细管床和腹膜,研究活体murine心脏组织中的冠状微循环,因为隔膜动脉是可控和加压的。
冠状动脉色调以及毛细血管的开启或关闭在很大程度上决定了在不断的输液压力向心肌细胞的血液。然而,很难监测整个心脏冠状动脉和毛细血管的动态变化,这主要是由于它的运动和不停的跳动。在这里,我们描述了一种方法,使监测动脉输液率,压力和直径变化的动脉和毛细血管在小鼠右心室肌肉。鼠标隔膜动脉在恒定的流量或压力下与另一个动态测量一起凝结和灌注。在用荧光标记的叶酸(例如, Alexa Fluor – 488 或 – 633 标记为小麦 – 格姆阿胶素, WGA ))进行注水后,右心室肌和隔膜中的动脉和毛细血管(和其他血管)很容易成像。然后,在存在或没有心脏收缩的情况下,可以测量容器直径的变化。当基因编码的荧光蛋白表达时,可以监测特定特征。例如,在表达NG2-DsRed的鼠标心脏中可视化了心率。该方法为研究毛细毛虫在心脏的生理功能提供了有益的平台。它还适用于通过同时测量血管/毛细管直径和动脉发光压力来研究试剂对心脏血流量的影响。这种准备,结合最先进的光学成像系统,使人们能够研究血液流动及其控制在细胞和分子水平的心脏在近生理条件下。
适当的冠状动脉压力流量调节可保证心脏有足够的血液供应,以满足其代谢需求1.然而,尽管过去几十年在体内和体外进行了广泛的研究,但最近才清楚冠状动脉压力流在心脏中是如何动态调节的。原因之一是由于心脏的不断跳动,难以为此类研究建立生理工作模式。无论如何,已经建立了各种方法来观察活组织或动物的冠状微血管,但这些方法都未能达到恒定/稳定的焦点和测量压力,流量和微血管直径在同一时间2,3。10年前,在跳动的心脏中引入了冠状动脉微血管的直接可视化,但小血管的直径测量具有挑战性,许多与微循环相关的专门细胞类型的特定功能同样令人烦恼。即使是频闪法和浮动目标系统也不能同时提供上述信息。然而,使用上述技术已获得大量有价值的资料,这有助于我们更深入地了解冠状动脉血流的调节。本文描述的方法将帮助人们详细研究和理解冠状动脉、动脉和微血管的成分对刺激和代谢需求的反应。
我们为开展这些研究而建立的工作模式是建立在韦斯特霍夫等人先前的工作基础上的。在小鼠心脏的隔膜动脉凝固后,生理盐水溶液用于渗透动脉,以保持肌细胞和心脏组织的其他成分滋养。使用适当的荧光指示器监测动脉注水压力、流量和血管直径等生理功能。该方法使我们能够在活组织生理压力下可视化冠状微血管床,并首次研究微循环调节背后的细胞机制。
在目前的工作中,我们引入了一种非常简单但非常实用的外生体方法,以研究生理条件下心脏的冠状微循环。这种方法是从机械调查修改使用大鼠2。具有挑战性的新增技术是高速和高光学分辨率的成像技术。因此,我们能够利用目前市售的先进光学成像系统。通过仔细解剖和放置功能肌肉准备在有利的位置,我们能够可视化动脉,毛细血管前动脉,毛细血管,以及腹膜,并能够…
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分得到了生物医学工程和技术中心的支持:NIH (1U01HL116321) 和 (1R01HL142290) 和美国心脏协会 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |