Observação microscópica da Dinâmica do Linfócito em Patches de Rat Peyer
Summary
Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.
Abstract
Linfócitos ingênuos recirculam do sangue para os tecidos linfoides sob condição fisiológica e é comumente reconhecido como um fenômeno importante na imunidade intestinal. O estroma de órgãos linfoides secundários, como as manchas de Peyer (PPs) ou linfonodos mesentéricos, são onde linfócitos ingênuos sentem antígenos. Linfócitos ingênuos circulam pela corrente sanguínea para alcançar venules endoteliais elevados, o portal de entrada em PPs. Estima-se que alguns imunomoduladores influenciem a migração de linfócitos, mas a avaliação precisa da dinâmica da microcirculação é muito difícil, e estabelecer um método para observar a migração de linfócitos in vivo pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos precisos. Refinamos o método de coleta de linfócitos do ducto linfático e observação da dinâmica detalhada dos linfócitos gut-trópicos em PPs de ratos. Escolhemos microscopia de varredura a laser confocal para observar PPs de ratos in vivo e gravamos usando fotografia de lapso de tempo. Agora podemos obter imagens claras que podem contribuir para a análise da dinâmica do linfócito.
Introduction
As manchas de Peyer (PPs) consistem em centenas de folículos linfoides na álmina propria do intestino delgado. Os PPs são divididos em folículos, região interfollicular e centros germinais localizados na parte inferior dos folículos, onde linfócitos são estimulados pela apresentação de antígeno. Não há vasos linfáticos diferentes, e os antígenos invadem a órmina propria do lúmen intestinal através da camada celular epitelial. A região epitelial que cobre folículos linfoides é chamada de epitélio associado ao folículo, dentro do qual células M intercaladas especializadas captam antígenos mucosais. As células M tomam antígenos do lado luminal e os antígenos são então capturados por células dendríticas e apresentados em direção a linfócitos ingênuos que fluem para PPs através do endotélio de venules endoteliais elevados (HEVs)1. Os PPs desempenham um papel importante na imunidade intestinal e estão relacionados com o estágio inicial da inflamação. Muitas interações moleculares envolvem a entrada de linfócitos a órgãos linfoides secundários (SLOs), incluindo moléculas de adesão, quimiocinas2,3e sphingosina-1-fosfato4; assim, há muitos alvos terapêuticos esperados. Portanto, observar a dinâmica do linfócito dentro dos PPs nos permite vislumbrar o estágio inicial da inflamação e examinar a utilidade de várias drogas promissoras.
O método aqui se concentra na migração de linfócitos em PPs, que inclui vários procedimentos (cannulação no ducto torácico5 e coleta de linfócitos e observação a longo prazo após a injeção em linfócitos coletados). Como esses procedimentos são complexos e foi difícil ver exatamente como cada procedimento foi realizado em relatórios anteriores, mencionamos aqui algumas dicas para conseguir uma observação bem sucedida. Por exemplo, a canulação dos tubos no ducto torácico foi muito difícil, e a taxa inicial de sucesso da canulação foi inferior a 50%. No entanto, melhoramos o método e alcançamos uma taxa de sucesso superior a 80%. Mencionamos algumas outras dicas neste manuscrito que são necessárias para a observação bem sucedida para permitir a avaliação quantitativa da migração transendotelial de linfócitos em várias condições.
Em relatórios anteriores, era difícil entender as mudanças tridimensionais ao longo do tempo, como a injeção intravenosa de tinta da Índia para manchar a estrutura vascular dos PPs6, ou o microscópio sendo monofocal7. Nos últimos anos, um método observacional utilizando alguns animais transgênicos de proteína fluorescência fotoconvertível, como camundongos Kaede, esclareceu movimentos celulares sistemáticos in vivo8. O outro estudo esclareceu o desligamento independente do CD69 da saída de linfócitos dos PPs9. Utilizamos microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) devido à sua alta capacidade analítica. Agora podemos facilmente obter imagens de alta resolução e usá-las para analisar a dinâmica do linfócito.
Neste relatório, demonstramos uma série de métodos para avaliar a migração de linfócitos em PPs. Primeiro, mostramos métodos refinados de cannulação do ducto torácico para coletar linfócitos. Em segundo lugar, melhoramos os métodos observacionais de várias maneiras para manter órgãos objetivos sempre que possível sob observação microscópica, permitindo-nos obter imagens de alta qualidade por 3 horas. Em terceiro lugar, quantificamos os movimentos celulares da migração de linfócitos para avaliar os efeitos de alguns medicamentos. Esses protocolos modificados contribuirão para o desenvolvimento de avaliações de imunologia mucosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um protocolo para coletar linfócitos ingenuos e trópicos ingenuos e observar sua migração em PPs de ratos. Esses procedimentos podem revelar como os linfócitos se movem na microvasculatura dos PPs e possibilitar comparar visualmente sua dinâmica em uma condição normal ou medicada. A observação direta dessas dinâmicas tem muito mérito em obter uma pista para modificação imunológica por algumas drogas, embora o período observacional seja limitado a apenas algumas horas.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da National Defense Medical College e de uma bolsa de pesquisa em Saúde e Ciências do Trabalho para pesquisas sobre doenças intratáveis do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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