Mikroskopisk observation af lymfocytdynamik i Rotte Peyers patches
Summary
Her beskriver vi en præcis metode til indsamling af thoraxkanallymfocytter og observation af migrationen af tarmtropiske lymfocytter i rotte Peyers pletter i 3 timer ved hjælp af time-lapse fotografering. Denne teknik kan afklare, hvordan dynamikken i lymfocytter påvirkes under inflammatoriske tilstande.
Abstract
Naive lymfocytter recirkulerer fra blodet til lymfoide væv under fysiologisk tilstand, og det er almindeligt anerkendt som et vigtigt fænomen i tarmens immunitet. Stroma af sekundære lymfoide organer, såsom Peyer’s patches (PPs) eller mesenteric lymfeknuder, er, hvor naive lymfocytter forstand antigener. Naive lymfocytter cirkulerer gennem blodbanen for at nå høje endotel venules, portalen for indrejse i PPs. Nogle immunmodulatorer skønnes at påvirke lymfocytmigrationen, men den præcise vurdering af mikrocirkulationsdynamikken er meget vanskelig, og etablering af en metode til at observere lymfocytmigration in vivo kan bidrage til afklaringen af de præcise mekanismer. Vi raffinerede metoden til indsamling af lymfocytter fra lymfekanalen og observerede den detaljerede dynamik i tarm-trope lymfocytter hos rotteP’er. Vi valgte confocal laserscanning mikroskopi til at observere rotteP’er in vivo og indspillede det ved hjælp af time-lapse fotografering. Vi kan nu få klare billeder, der kan bidrage til analysen af lymfocytdynamik.
Introduction
Peyer’s patches (PPs) består af hundredvis af lymfoid follikler i lamina propria af tyndtarmen. PPs er opdelt i follikler, den interfollicular region, og germinal centre placeret i den nederste del af folliklerne, hvor lymfocytter stimuleres af antigen præsentation. Der er ingen afferente lymfekar, og antigene invaderer lamina propria fra tarm lumen via epitelcellelaget. Den epitel region, der dækker lymfoid follikler kaldes follikel-associeret epitel, inden for hvilken specialiserede afbrudte M-celler optagelse slimhindeantigener. M celler tage i antigener fra luminal side og antigener er derefter fanget af dendritiske celler og præsenteres mod naive lymfocytter, der strømmer ind i PPs gennem endothelium af høje endotel venules (HEVs)1. PPs spiller en vigtig rolle i tarmimmunitet og er relateret til den tidlige fase af inflammation. Mange molekylære interaktioner involverer indgangen til lymfocytter til sekundære lymfoide organer (SLOs), herunder vedhæftningsmolekyler, kemokiner2,3og sphingosin-1-fosfat4; der er således mange forventede terapeutiske mål. Derfor gør observation af lymfocytdynamikken inden for PPs det muligt for os at få et glimt af det meget tidlige stadium af inflammation og undersøge nytten af flere lovende lægemidler.
Metoden her fokuserer på migration af lymfocytter i PPs, som omfatter flere procedurer (cannulation i brystkanalen5 og indsamling lymfocytter og langsigtet observation efter injektionen i indsamlede lymfocytter). Da disse procedurer er komplekse, og det var vanskeligt at se nøjagtigt, hvordan hver procedure blev udført i tidligere rapporter, nævnte vi her nogle tips til at opnå en vellykket observation. For eksempel var cannulation af rørene i brystkanalen meget vanskelig, og den oprindelige succesrate for cannulation var mindre end 50%. Vi forbedrede imidlertid metoden og opnåede en succesrate på over 80 %. Vi nævnte nogle andre tips i dette manuskript, der er nødvendige for en vellykket observation for at muliggøre den kvantitative evaluering af transendotelmigrationen af lymfocytter under flere forhold.
I tidligere rapporter var det svært at forstå de tredimensionelle ændringer over tid, såsom intravenøs injektion af indisk blæk for at plette den vaskulære struktur af PPs6, eller mikroskopet er monofokal7. I de senere år har en observationsmetode ved hjælp af nogle fotokonvertible fluorescensproteintransgene dyr som Kaede mus afklaret systematiske cellulære bevægelser in vivo8. Den anden undersøgelse præciseret CD69 uafhængig nedlukning af lymfocyt udgang fra PPs9. Vi brugte confocal laserscanning mikroskopi (CLSM) på grund af sin høje analytiske kapacitet. Nu kan vi nemt få billeder i høj opløsning og bruge dem til at analysere lymfocytdynamik.
I denne rapport demonstrerede vi en række metoder til evaluering af lymfocytmigration i PPs. For det første viste vi raffinerede metoder til thoraxkanal cannulation at indsamle lymfocytter. For det andet forbedrede vi observationsmetoderne på flere måder for at opretholde objektive organer, når det var muligt under mikroskopisk observation, så vi kunne få billeder i høj kvalitet i 3 timer. For det tredje kvantificerede vi de cellulære bevægelser af lymfocytmigration for at evaluere virkningerne af nogle medikamenter. Disse ændrede protokoller vil bidrage til udviklingen af slimhinde immunologi evalueringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en protokol for indsamling af naive tarm-trope lymfocytter og observere deres migration i rotteP’er. Disse procedurer kan afsløre, hvordan lymfocytter bevæger sig i mikrovasculature af PPs og gøre det muligt at visuelt sammenligne deres dynamik under en normal eller medicineret tilstand. Den direkte observation af disse dynamikker har meget værdi at få et fingerpeg om immunologisk modifikation af nogle lægemidler, selv om observationsperioden er begrænset til kun et par timer.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Defense Medical College og af en Health and Labour Sciences forskning tilskud til forskning i genstridige sygdomme fra Ministeriet for Sundhed, Arbejde og Velfærd, Japan.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
