Observation microscopique de la dynamique des lymphocytes dans les patchs de Rat Peyer
Summary
Ici, nous décrivons une méthode précise pour recueillir les lymphocytes thoraciques de conduit et observer la migration des lymphocytes intestin-tropiques dans les corrections de Rat Peyer pendant 3 heures utilisant la photographie de time-lapse. Cette technique peut clarifier comment la dynamique des lymphocytes sont affectés dans des conditions inflammatoires.
Abstract
Les lymphocytes naïfs recirculent du sang aux tissus lymphoïdes dans un état physiologique et il est généralement reconnu comme un phénomène important dans l’immunité intestinale. Le stroma des organes lymphoïdes secondaires, tels que les patchs de Peyer (PPs) ou les ganglions lymphatiques mésentériques, sont l’endroit où les lymphocytes naïfs détectent les antigènes. Les lymphocytes naïfs circulent dans le sang pour atteindre les venules endothéliales élevées, le portail d’entrée dans les PPP. On estime que certains immunomodulateurs influencent la migration des lymphocytes, mais l’évaluation précise de la dynamique de microcirculation est très difficile, et l’établissement d’une méthode pour observer la migration des lymphocytes in vivo peut contribuer à la clarification des mécanismes précis. Nous avons affiné la méthode de collecte des lymphocytes du conduit lymphatique et d’observation de la dynamique détaillée des lymphocytes intestino-tropiques chez les rats. Nous avons choisi la microscopie confoccale de balayage de laser pour observer des PP de rat in vivo et l’avons enregistrée utilisant la photographie de time-lapse. Nous pouvons maintenant obtenir des images claires qui peuvent contribuer à l’analyse de la dynamique des lymphocytes.
Introduction
Les patchs de Peyer (PPs) se composent de centaines de follicules lymphoïdes dans la propria lamina de l’intestin grêle. Les PPP sont divisés en follicules, la région interfollicular, et les centres germinaux situés dans la partie inférieure des follicules, où les lymphocytes sont stimulés par la présentation d’antigène. Il n’y a pas de vaisseaux lymphatiques afferents, et les antigènes envahissent le propria lamina du lumen intestinal par l’intermédiaire de la couche épithéliale de cellules. La région épithéliale couvrant les follicules lymphoïdes est appelée épithélium associé au follicule, dans lequel les cellules M intercalées spécialisées absorptionnt des antigènes muqueux. Les lymphocytes M prennent des antigènes du côté luminal et les antigènes sont ensuite capturés par des cellules dendritiques et présentés vers des lymphocytes naïfs qui s’écoulent dans les PPP par l’endothelium des venules endothéliales élevées (HEVs)1. Les PPP jouent un rôle important dans l’immunité intestinale et sont liés au stade précoce de l’inflammation. Beaucoup d’interactions moléculaires impliquent l’entrée des lymphocytes aux organes lymphoïdes secondaires (SLOs), y compris des molécules d’adhérence, des chemokines2,3,et la sphingosine-1-phosphate4; ainsi, il y a beaucoup de cibles thérapeutiques prévues. Par conséquent, l’observation de la dynamique des lymphocytes dans les PPP nous permet d’apercevoir le stade très précoce de l’inflammation et d’examiner l’utilité de plusieurs médicaments prometteurs.
La méthode se concentre ici sur la migration des lymphocytes dans les PPP, qui comprend plusieurs procédures (cannulation dans le conduit thoracique5 et la collecte des lymphocytes et l’observation à long terme après l’injection dans les lymphocytes collectés). Étant donné que ces procédures sont complexes et qu’il était difficile de voir exactement comment chaque procédure a été effectuée dans des rapports précédents, nous avons mentionné ici quelques conseils pour parvenir à une observation réussie. Par exemple, la cannulation des tubes dans le conduit thoracique était très difficile, et le taux de succès initial de la cannulation était inférieur à 50%. Cependant, nous avons amélioré la méthode et obtenu un taux de réussite supérieur à 80%. Nous avons mentionné quelques autres bouts dans ce manuscrit qui sont nécessaires pour l’observation réussie pour permettre l’évaluation quantitative de la migration transendothelial des lymphocytes dans plusieurs conditions.
Dans les rapports précédents, il était difficile de comprendre les changements tridimensionnels au fil du temps, tels que l’injection intraveineuse de l’encre de Chine pour tacher la structure vasculaire desPPP 6, ou le microscope étant monofocal7. Ces dernières années, une méthode d’observation utilisant certains animaux transgéniques de protéine de fluorescence photoconvertible tels que les souris de Kaede ont clarifié les mouvements cellulaires systématiques in vivo8. L’autre étude a clarifié l’arrêt indépendant cd69 de l’évacuation des lymphocytes desPPP 9. Nous avons utilisé la microscopie à balayage laser confoccal (CLSM) en raison de sa capacité d’analyse élevée. Maintenant, nous pouvons facilement obtenir des images à haute résolution et les utiliser pour analyser la dynamique des lymphocytes.
Dans ce rapport, nous avons démontré une série de méthodes pour évaluer la migration de lymphocyte dans les PPP. Tout d’abord, nous avons montré des méthodes raffinées de cannulation thoracique des conduits pour recueillir les lymphocytes. Deuxièmement, nous avons amélioré les méthodes d’observation de plusieurs façons pour maintenir les organes objectifs dans la mesure du possible sous observation microscopique, ce qui nous a permis d’obtenir des images de haute qualité pendant 3 heures. Troisièmement, nous avons quantifié les mouvements cellulaires de la migration des lymphocytes pour évaluer les effets de certains médicaments. Ces protocoles modifiés contribueront au développement d’évaluations d’immunologie muqueuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous avons décrit un protocole pour recueillir les lymphocytes intestin-tropiques naïfs et observer leur migration dans des PP de rat. Ces procédures peuvent révéler comment les lymphocytes se déplacent dans la microvasculature des PPP et rendre possible de comparer visuellement leur dynamique dans un état normal ou médicamenteux. L’observation directe de ces dynamiques a beaucoup de mérite pour obtenir un indice de modification immunologique par certains médicaments, bien que la période d’observation …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par des subventions du National Defense Medical College et par une subvention de recherche en sciences de la santé et du travail pour la recherche sur les maladies insolubles du ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être social, au Japon.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
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