硅纳米线与光学刺激研究细胞内和细胞间电耦合
Summary
该协议描述了使用硅纳米线在细胞内光学生物调制细胞在简单和易于执行的方法。该技术高度适应不同的细胞类型，可用于体外和体内应用。
Abstract
肌纤维细胞可以自发地内化硅纳米线（SiNWs），成为生物电子应用的有吸引力的目标。这些细胞硅混合器件提供无铅光调制功能，对正常细胞行为的扰动最小。光功能由SiNW的光热和光电特性获得。这些杂交种可以使用标准组织培养技术进行收获，然后应用于不同的生物情景。我们在这里演示如何使用这些杂交体来研究心脏细胞的电耦合，并比较肌纤维细胞如何耦合彼此或心肌细胞。除了荧光显微镜和耦合激光线之外，无需特殊设备即可完成此过程。还显示使用定制的MATLAB例程，允许钙在培养中不同细胞内和不同细胞之间进行定量传播。显示肌纤维细胞的电反应比心肌细胞的电反应慢。此外，肌纤维细胞间传播显示稍慢，尽管其细胞内速度相当，表明通过间隙结或纳米管进行被动传播。这种技术具有很强的适应性，可以很容易地应用于其他细胞竞技场，用于体外以及体内或体外调查。
Introduction
所有生物有机体都使用离子形式的电来调节细胞行为。细胞膜包含各种类型的特定离子通道，允许离子的被动和主动传输。这些离子控制兴奋细胞的功能，如神经元活动、骨骼和心肌收缩。然而，生物电在非兴奋细胞中也起着重要的作用，它控制着许多细胞功能，如细胞增殖1、神经免疫2、3、4和干细胞分化5。
近几十年来，生物电领域引起了越来越多的关注，这促进了生物电子接口众多技术的发展。微电极贴片移液器是细胞内记录和刺激的黄金标准6。在这种方法中，玻璃移液器在特定条件下被拉扯，形成孔径为几微米的锋利边缘。此移液器充满缓冲器，移液器允许缓冲器与细胞内体积直接接触。这会产生一个生物电接口，产生极高的信噪比、对蜂窝电活动的精确控制以及极高的时间分辨率。虽然这种方法是一个极其强大的工具，最近被缩小为纳米移液器配置7，它与几个重要的技术限制有关。细胞胶稀释效应8，以及机械振动，将其效用限制在短期的审讯，它需要昂贵的专业设备和高水平的技术技能。此外，它的体积限制可以同时记录或刺激的细胞数量，并且由于其侵入性，它不能在整个实验中重新配置。为了克服这些限制，开发了微电极阵列，但电极的大小限制了空间分辨率以及细胞内访问。Nanoelectrode阵列允许细胞内记录和刺激，但需要磨蚀性电穿孔才能访问细胞胶9，10。此外，所有这些方法都是基质束缚的，因此仅限于体外细胞培养，或外部表面细胞，无法接触到三维（3D）组织内的细胞。
光遗传学11 被广泛用于解决这些3D和体内的限制。然而，光遗传学方法基于在等离子膜上分布的光激活等离子离子通道的扰动，限制了3D空间分辨率12 和细胞内功能。
我们最近发现，硅纳米线（SiNWs）可用于用亚微米空间分辨率进行细胞内生物电检测，具有不同的非兴奋细胞，即心肌细胞和寡头细胞13。此外，我们使用这些SiNW在3D心脏组织内进行前活细胞特异性询问，调查心脏细胞在体内如何电对14。这种方法的一个主要优点是它简单;它不需要任何基因改造或笨重的仪器。许多细胞会自发内化光反应的SiNW，无需声波或电穿孔15。此外，他们将自发地逃离内体封装，与细胞胶和细胞内细胞器13，15形成无缝整合。这些细胞-SiNW复合材料，称为细胞-硅混合体，具有原始细胞的动态、柔软和多功能特性，以及SiNW的光电功能。杂交后，利用标准组织培养技术采集细胞-SiNW杂交，用于细胞内生物电刺激等各种应用;体外研究细胞间生物电耦合;和体内细胞特定的审讯。由于有效的刺激需要高光功率密度和SiNW的共同定位，因此可以实现2D和3D的高空间分辨率。在该协议中，我们详细描述了方法，以及如何分析结果。重点是体外细胞内和细胞间研究，但这种方法的体内实施可直接用于许多其他生物情景。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在这里演示了一种执行细胞内电刺激的简单方法。在此演示中，我们使用与 SiGW 预混合的 MF，然后与 CMs 共同培养。一般来说，大多数增殖细胞有内化SiNW的倾向，这允许此方法与许多其他细胞类型使用。此外，虽然我们展示了细胞的细胞内刺激，但同样的原理可以用来对细胞进行细胞外刺激。这可以通过阻止内染色体级联15个细胞自发内化它们， 或使用不内化 SiNW 的细胞来?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到空军科学研究办公室（AFOSR FA9550-18-1-0503）的支持。
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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