Sammlung von Skelettmuskelbiopsien aus dem Superior-Fach des menschlichen Musculus Tibialis Anterior für mechanische Bewertung

Summary

Dieser technische Bericht beschreibt eine Variation der modifizierten Bergström-Technik für die Biopsie des Musculus tibialis anterior, die Faserschäden begrenzt.

Abstract

Die mechanischen Eigenschaften der Kontraktion von Skelettfasern sind entscheidende Indikatoren für die allgemeine Muskelgesundheit, Funktion und Leistung. Menschliche Skelettmuskelbiopsien werden oft für diese Bemühungen gesammelt. Es liegen jedoch relativ wenige technische Beschreibungen von Biopsieverfahren außerhalb des häufig verwendeten Musculus vastus lateralis vor. Obwohl die Biopsie-Techniken oft an die Eigenschaften der einzelnen untersuchten Muskeln angepasst werden, teilen nur wenige technische Berichte diese Veränderungen an die größere Gemeinschaft. So wird Muskelgewebe von menschlichen Teilnehmern oft verschwendet, wenn der Bediener das Rad neu erfindet. Die Erweiterung des verfügbaren Materials auf Biopsien aus einer Vielzahl von Muskeln kann den Vorfall von fehlgeschlagenen Biopsien reduzieren. Dieser technische Bericht beschreibt eine Variation der modifizierten Bergström-Technik auf dem Musculus tibialis vorder, die Faserschäden begrenzt und Faserlängen bereitstellt, die für eine mechanische Auswertung geeignet sind. Die Operation ist ein ambulanter Eingriff, der in einer Stunde abgeschlossen werden kann. Die Erholungsphase für dieses Verfahren ist sofort für leichte Aktivität (d.h. Gehen), bis zu drei Tage für die Wiederaufnahme der normalen körperlichen Aktivität, und etwa eine Woche für die Wundversorgung. Das extrahierte Gewebe kann für mechanische Kraftexperimente verwendet werden und hier stellen wir repräsentative Aktivierungsdaten vor. Dieses Protokoll eignet sich für die meisten Sammelzwecke, möglicherweise an andere Skelettmuskeln anpassbar und kann durch Änderungen an der Sammelnadel verbessert werden.

Introduction

Die Untersuchung der menschlichen Muskelphysiologie für klinische oder Forschungszwecke erfordert oft Muskelbiopsien. Eine große Herausforderung in der menschlichen Muskelphysiologie und Biomechanik besteht beispielsweise darin, die verschiedenen Anpassungen der Muskelleistung an das Training zu unterscheiden und zu verstehen. Leistungsanpassungen umfassen nicht nur strukturelle Anpassungen (z. B. Veränderungen der kontraktilen Proteine, Muskelarchitektur), sondern auch neuronale Anpassungen¹, die sehr schwer, wenn nicht gar unmöglich sind, getrennt zu beurteilen, wenn sie intakte menschliche Muskeln in situ testen. Faser-Level-Experimente entfernen diese höherwertigen Komponenten und ermöglichen eine direktere Bewertung der Muskelkontraktion und können über Biopsietechniken gesammelt werden. Muskelbiopsien wurden seit mindestens 1868^{gesammelt 2}. Heute ist die vorherrschende Technik, Um Muskelbiopsien zu sammeln, die modifizierte Bergström-Technik^3,4,5, obwohl andere Techniken verfügbar sind, einschließlich der Verwendung eines Weil-Blakesley-Conchotoms⁶ oder der sogenannten Feinnadel^7,8. Alle diese Techniken verwenden spezielle nadelähnliche Instrumente, die entworfen wurden, um in den Muskel zu gelangen und ein Stück Gewebe zu schneiden. Insbesondere verwendet die modifizierte Bergström-Technik eine große modifizierte Nadel (hier 5 mm Nadelgröße; Abbildung 1) die ein Fenster in der Nähe der Nadelspitze und einen kleineren internen Trokar hat, der sich nach oben und unten bewegt und den Muskel beim Passieren des Nadelfensters schneidet. Innerhalb dieses heiligen Trokars befindet sich ein Ramrod, der sich den Schaft des Trokars auf und ab bewegt und die Biopsie in Richtung Nadelfenster schiebt. Um den Muskel in das Nadelfenster zu ziehen, wird ein Saugschlauch befestigt, der Luft aus der Nadel saugt und den Muskel über Unterdruck in das Nadelfenster zieht.

Muskelbiopsien werden oft erworben, um Veränderungen im Proteingehalt, genexpression oder Morphologie, die durch Krankheit oder in einer Reaktion auf ein Übungsprogramm^verursachtwerden, zu untersuchen 1^,9,10,11. Ein weiterer kritischer Einsatz für Muskelbiopsien sind mechanische Experimente wie die Messung von Faserkontraktilenkraft, Muskelfasersteifigkeit und geschichtsabhängigen Muskeleigenschaften^{12,13,14,15,16}. Die Einzelfaser- oder Faserbündelmechanik wird durch Anbringen von Fasern zwischen einem Längenmotor und einem Kraftwandler auf speziellen Bohrständen gemessen, die die Faserlänge steuern und gleichzeitig die Kraft messen. Durch permeabilisierende (z.B. Enthäutung) von Fasern wird die Sarcolemma-Membran für Chemikalien in der Badlösung durchlässig, was eine Aktivierungskontrolle durch unterschiedliche Kalziumkonzentration ermöglicht. Darüber hinaus kann die Wirkung kontraktiler Eigenschaften auf Chemikalien/Pharmazeutika/andere Proteine leicht bewertet werden, indem das betreffende Reagenz der Badlösung hinzugefügt wird. Während diese Technik in anderen Tiermodellen sehr stark verwendet wird, führten deutlich weniger Studien mechanische Tests an gehäuteten Fasern aus menschlichen Muskelbiopsien^17,18,19durch. Ein Grund dafür ist, dass die Biopsiewerkzeuge und -protokolle so konzipiert sind, dass sie so viel Muskelgewebe wie möglich entfernen, wobei die Höhe der strukturellen Schäden, die während der Gewebeextraktion erlitten werden, geringer ist. In der Tat, ein aktuelles Biopsie-Protokoll schlägt vor, die Biopsienadel in den Muskel zu treiben und 2-4 Stücke von Muskel³zu sammeln. Der Prozess selbst verursacht wenig Schaden an der DNA oder dem Proteinmaterial, zerstört aber oft Faser- und sarkomische Strukturen so, dass die Aktivierung von Muskelfasern instabil oder unmöglich wird. Darüber hinaus ist die relative Länge der Fasern innerhalb der Biopsie in der Regel kurz (<2 mm) und nicht leicht für mechanische Tests zu handhaben. Für mechanische Prüfungen sind ideale Fasern lang (3-5 mm) und nicht strukturell beschädigt.

Fortschrittlichere Gewebeextraktionstechniken können verwendet werden, um Faserschäden zu begrenzen. So nutzte eine Gruppe²⁰ die zuvor geplanten “offenen Operationen” von Unterarmen (z.B. Knochenbruchreparatur), bei denen die Muskeln vollständig exponiert waren und ein Chirurg die Muskelstruktur visualisieren und relativ große und strukturell unbeschädigte Proben von Muskelgewebe (15 mm x 5mm x 5 mm) sorgfältig sezieren konnte. Diese “offene Biopsie”-Technik wird bevorzugt, wenn die Teilnehmer ein zuvor geplantes Verfahren durchlaufen, und schränkt so den Pool potenzieller Teilnehmer ein, insbesondere für gesunde Erwachsene, wo sonst keine Operationen stattfinden würden. So werden viele Zu Forschungszwecken durchgeführte Biopsien als ambulantes Verfahren durchgeführt und die Einschnittstelle wird so klein wie möglich gehalten, um das Infektionsrisiko, Narbenbildung und Heilungszeit zu begrenzen. Daher werden die meisten Biopsien blind gesammelt (d.h. der Bediener kann die Sammelnadel nicht sehen, wenn sie durch die Faszie in den Muskel gelangt). Dies impliziert, dass die Qualität der Biopsie fast ausschließlich auf den Fähigkeiten und Erfahrungen des Bedieners basiert. Jeder Muskel hat seine eigenen Schwierigkeiten beim Sammeln von Gewebe, wie Risiken, Nerven und Blutgefäße zu verletzen, Auswahl einer idealen Sammlungstiefe und -position, und die Entscheidung über eine geeignete Körperposition, um den Muskel so locker wie möglich zu halten. Leider sind die meisten muskelspezifischen Fähigkeiten nicht aufgeschrieben und so muss jeder Arzt “das Rad neu erfinden”, wenn er Biopsien an Muskeln durchführt, die für sie neu sind. Dieser Mangel an Erfahrung führt in der Regel zu mehreren Sammlungen mit geringer Qualität, bis der Arzt die besten Praktiken für Biopsien auf diesem Muskel identifiziert. Anfänger lernen das Können oft durch Gespräche mit ihren erfahreneren Kollegen, aber es gibt relativ wenige informative und begutachtete Texte zu diesem Thema, insbesondere für Muskeln, die traditionell nicht für die Biopsiesammlung verwendet werden. Betrachtet man die oben genannten Informationen, zusammen mit der Schwierigkeit, menschliche Freiwillige für Biopsien zu rekrutieren, ist es klar, dass mehr Lehrinformationen benötigt werden, die die Erfolgschancen für jeden Teilnehmer maximieren.

So war der Zweck dieses Papiers, eine Muskelbiopsie-Technik zu präsentieren, die Protokolle für die erfolgreiche Sammlung von Muskelbiopsien mit langen, unbeschädigten Faserfragmenten für mechanische Tests bereitstellt. Menschliche Muskelbiopsien werden in der Regel durchgeführt, und der Großteil des Biopsie-Trainingsmaterials ist auf, der Musculus vastus lateralis. Seine relativ große Muskelgröße und oberflächliche Lage relativ zur Haut ermöglicht die Sammlung von angemessenem Muskelgewebe, während die Minimierung von Patientenbeschwerden und körperlichen Trauma^1,21. Allerdings gibt es einige Einschränkungen bei der Verwendung der vastus lateralis für Längsinal-Training-Studien. Beispielsweise müssen die Teilnehmer während experimenteller Protokolle, die ein Schulungsprogramm enthalten, für einen Zeitraum von oft 2-6 Monaten auf eine zusätzliche Ausbildung außerhalb der Studie verzichten. Für Sportler ist dies oft nicht möglich, da der vastus lateralis in der Regel bei typischen Übungen (z.B. Kniebeugen, Sprünge) trainiert wird oder in der Regel für den Sport (z.B. Laufen, Radfahren) verwendet wird. Diese getrennten Trainingserfahrungen abseits des Studienziels können Muskelanpassungen bewirken, die Muskelmechanik, Architektur und Physiologie so verändern, dass es schwierig oder unmöglich ist, die wahre Wirkung des experimentellen Protokolls der Studie auf die Muskeleigenschaften zu kennen. Für diese Art von Studien wäre es ideal, einen Zielmuskel auszuwählen, der oft nicht im Mittelpunkt der Ausbildung von Regimentern steht. Der musculus tibialis anterior (TA) ist ein idealer Zielmuskel, der die oben genannten Anforderungen erfüllt. Darüber hinaus können Trainingsinterventionen mit kontrollierbaren Ansätzen, wie z.B. mit einem Dynamometer, auf die TA ausgerichtet werden. Es gibt fast kein Trainingsmaterial zu einer TA-Muskelbiopsie. Daher haben wir ein modifiziertes Protokoll entwickelt, um relativ unbeschädigte Muskelbiopsien aus der TA zu sammeln.

Protocol

HINWEIS: Im Folgenden skizzieren wir ein Protokoll zur Ernte mechanisch unbeschädigter Fasern aus der TA von Freiwilligen, die in einer separaten laufenden Studie eingeschrieben waren. Dieses Protokoll ähnelt dem von Shanely et al.3, die die modifizierte Bergström-Technik in vastus lateralis beschrieben haben. Die hier vorgestellten Informationen wurden von unserer Forschungsgruppe verfeinert, sind aber möglicherweise nicht für alle Laborgruppen oder Organisationseinrichtungen ideal. Wir gebe…

Representative Results

Die gesamte Zeitverpflichtung für einen Teilnehmer betrug etwa eine Stunde (10 min Beratung, 10 min Ultraschall, 20 min Chirurgische Vorbereitung und Anästhesie, 10 min Operation und 10 min Erholung). Oft aktivierten die Teilnehmer unbewusst ihre TA und benötigten konsistente Erinnerungen, um den Muskel so entspannt wie möglich zu halten. Wenn sich die Biopsienadel im Muskel befand, berichteten die Teilnehmer in der Regel von einem einzigartigen “Druck”-Gefühl im Bereich um die Biopsienadel, mit gelegentlichen Perio…

Discussion

In diesem Bericht haben wir eine Technik zur Biopsie von strukturell unbeschädigtem Muskelgewebe von TA beschrieben. Wir fanden heraus, dass dieses Verfahren einen akzeptablen Gehalt an nutzbaren Muskelfasern (5-10 Faserbündelpräparate pro 50 mg gesammeltes Gewebe) für mechanische Tests liefert. Außerdem hatten wir genug Gewebe für mechanische, genetische und proteomische Folgeexperimente.

Es gibt mehrere Methoden in der Regel für die Sammlung von Muskelbiopsien^verwend…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction