Verzameling skeletspierbiopten uit het superieure compartiment van human musculus Tibialis Anterior voor mechanische evaluatie

Summary

Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek voor de biopsie van de musculus tibialis voorste die vezelschade beperkt.

Abstract

De mechanische eigenschappen van het samentrekken skeletvezels zijn cruciale indicatoren van de algehele gezondheid van de spieren, functie en prestaties. Menselijke skeletspier biopten worden vaak verzameld voor deze inspanningen. Er zijn echter relatief weinig technische beschrijvingen van biopsieprocedures beschikbaar, buiten de veelgebruikte musculus vastus lateralis. Hoewel de biopsietechnieken vaak worden aangepast aan de kenmerken van elke spier die wordt bestudeerd, delen weinig technische rapporten deze veranderingen aan de grotere gemeenschap. Zo wordt spierweefsel van menselijke deelnemers vaak verspild als de operator het wiel opnieuw uitvindt. Het uitbreiden van het beschikbare materiaal op biopten van een verscheidenheid van spieren kan het incident van mislukte biopten verminderen. Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek op het musculus tibialis voorste dat vezelschade beperkt en vezellengtes biedt die geschikt zijn voor mechanische evaluatie. De operatie is een poliklinische procedure die kan worden afgerond in een uur. De herstelperiode voor deze procedure is onmiddellijk voor lichte activiteit (d.w.z. lopen), tot drie dagen voor de hervatting van de normale fysieke activiteit en ongeveer een week voor wondverzorging. Het geëxtraheerde weefsel kan worden gebruikt voor mechanische krachtexperimenten en hier presenteren we representatieve activeringsgegevens. Dit protocol is geschikt voor de meeste verzameldoeleinden, mogelijk aanpasbaar aan andere skeletspieren, en kan worden verbeterd door wijzigingen aan de opvangnaald.

Introduction

De studie van menselijke spierfysiologie voor klinische of onderzoeksdoeleinden vereist vaak spierbiopten. Bijvoorbeeld, een grote uitdaging in de menselijke spierfysiologie en biomechanica is om onderscheid te maken tussen en begrijpen van de verschillende aanpassingen van spierprestaties uit te oefenen. Prestatieaanpassingen omvatten niet alleen structurele aanpassingen (bijvoorbeeld veranderingen in contractiele eiwitten, spierarchitectuur), maar ook neurale aanpassingen¹, die zeer moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, afzonderlijk te beoordelen bij het testen van intacte menselijke spieren. Vezel-niveau experimenten verwijderen deze hogere orde componenten en zorgen voor een meer directe evaluatie van spiercontractie en kan worden verzameld via biopsie technieken. Spierbiopten zijn verzameld sinds ten minste 1868². Vandaag de dag is de belangrijkste techniek om spierbiopten te verzamelen de gewijzigde Bergström techniek^3,4,5, hoewel andere technieken beschikbaar zijn, waaronder het gebruik van een Weil-Blakesley conchotome⁶ of de zogenaamde fijne naald^7,8. Al deze technieken maken gebruik van speciale naald-achtige instrumenten die zijn ontworpen om door te geven in de spier en snijd een stuk weefsel. Specifiek, de gewijzigde Bergström techniek maakt gebruik van een grote gemodificeerde naald (5 mm naald grootte hier; Figuur 1) dat heeft een venster dicht bij de naald tip en een kleinere interne trocar die beweegt op en neer de naald, het snijden van de spier bij het passeren over de naald venster. Binnen deze hallow trocar is een ramrod die beweegt op en neer de schacht van de trocar en duwt de biopsie naar de naald venster. Om de spier in het naaldvenster te trekken, wordt een zuigslang bevestigd, die lucht uit de naald zuigt en de spier in het naaldvenster door negatieve druk trekt.

Spierbiopten worden vaak verworven om veranderingen in het eiwitgehalte, genexpressie of morfologie veroorzaakt door ziekte of in reactie op een oefenprogramma^1,9,10,11te bestuderen . Een ander cruciaal gebruik voor spierbiopten is mechanische experimenten zoals het meten van vezelcontractielkracht, spiervezelstijfheid en geschiedenisafhankelijke spiereigenschappen^{12,13,14,15,16}. Enkele vezel of vezel bundel mechanica worden gemeten door het bevestigen van vezels tussen een lengte motor en kracht transducer op gespecialiseerde rigs die de vezel lengte controle, terwijl tegelijkertijd het meten van kracht. Door het permeabiliseren (bijvoorbeeld, villen) vezels, de sarcolemma membraan wordt doorlatend voor chemische stoffen in het bad oplossing, waardoor voor activering controle door verschillende calciumconcentratie. Bovendien kan het effect van contractiele eigenschappen op chemicaliën/farmaceutische producten/andere eiwitten gemakkelijk worden geëvalueerd door het betrokken reagens toe te voegen aan de badoplossing. Hoewel deze techniek veel wordt gebruikt in andere diermodellen, zijn er merkbaar minder studies uitgevoerd op gevilde vezels van menselijke spierbiopten^17,18,19. Een van de redenen is dat de biopsie tools en protocollen zijn ontworpen om zo veel spierweefsel mogelijk te verwijderen met minder respect voor het niveau van structurele schade opgelopen tijdens weefselextractie. Inderdaad, een recente biopsie protocol suggereert om de biopsie naald rijden in de spier en het verzamelen van 2-4 brokken van spier³. Het proces zelf doet weinig schade aan het DNA of eiwitmateriaal, maar vernietigt vaak vezels en sarcomerische structuren op een zodanige wijze dat de activering van spiervezels onstabiel of onmogelijk wordt. Bovendien is de relatieve lengte van vezels binnen de biopsie meestal kort (<2 mm) en niet gemakkelijk te hanteren voor mechanische tests. Voor mechanische testen zijn ideale vezels lang (3-5 mm) en niet structureel beschadigd.

Meer geavanceerde weefselextractie technieken kunnen worden gebruikt om vezelschade te beperken. Zo maakte één groep²⁰ gebruik van eerder geplande “open operaties” van onderarmen (bijvoorbeeld botbreukherstel), waarbij de spieren volledig werden blootgesteld en een chirurg in staat was om de spierstructuur te visualiseren en relatief grote en structureel onbeschadigde monsters van spierweefsel zorgvuldig te ontleden (15 mm x 5 mm x 5 mm). Deze “open biopsie” techniek is favoriet wanneer de deelnemers een eerder geplande procedure ondergaan, en dus beperkt de pool van potentiële deelnemers, vooral voor gezonde volwassenen, waar geen operaties anders zou plaatsvinden. Zo worden veel biopten uitgevoerd voor onderzoeksdoeleinden gedaan als een poliklinische procedure en de incisieplaats wordt zo klein mogelijk gehouden om het infectierisico, littekens en genezingstijd te beperken. Daarom worden de meeste biopten blindelings verzameld (d.w.z. de operator is niet in staat om de verzamelnaald te zien als deze door de fascia in de spier gaat). Dit houdt in dat de kwaliteit van de biopsie bijna volledig is gebaseerd op de vaardigheid en ervaring van de operator. Elke spier heeft zijn eigen problemen bij het verzamelen van weefsel, zoals risico’s om zenuwen en bloedvaten te schenden, selectie van een ideale collectie diepte en locatie, en de beslissing over een geschikte lichaamshouding om de spier zo slap mogelijk te houden. Helaas, de meeste van de spier-specifieke skillsets zijn niet opgeschreven en dus elke arts moet “opnieuw uitvinden van het wiel” bij het uitvoeren van biopten op spieren nieuw voor hen. Dit gebrek aan ervaring leidt meestal tot verschillende collecties met een lage kwaliteit totdat de arts de beste praktijken voor biopten op die spier identificeert. Beginnende artsen leren de vaardigheid vaak door middel van gesprekken met hun meer ervaren collega’s, maar er bestaan relatief weinig informatieve en peer-reviewed teksten over de kwestie, vooral voor spieren die traditioneel niet worden gebruikt voor biopsieverzameling. Als we kijken naar de bovenstaande informatie, samen met de moeilijkheid van het werven van menselijke vrijwilligers voor biopten, is het duidelijk dat meer onderwijs informatie nodig is die de kans op succes voor elke deelnemer maximaliseert.

Het doel van dit document was dus om een spierbiopsietechniek te presenteren die protocollen biedt voor het succesvol verzamelen van spierbiopten met lange, onbeschadigde vezelfragmenten voor mechanische tests. Menselijke spierbiopten worden meestal uitgevoerd op, en het grootste deel van de biopsie training materiaal is op, de musculus vastus lateralis. De relatief grote spiergrootte en oppervlakkige locatie ten opzichte van de huid zorgt voor het verzamelen van voldoende spierweefsel, terwijl het minimaliseren van ongemak van de patiënt en fysiek trauma^1,21. Er zijn echter enkele beperkingen aan het gebruik van de vastus lateralis voor longitudinale trainingsstudies. Bijvoorbeeld, tijdens experimentele protocollen die een trainingsprogramma omvatten, moeten de deelnemers afzien van aanvullende training buiten de studie voor een periode die vaak 2-6 maanden beslaat. Voor atleten is dit vaak niet mogelijk, omdat de vastus lateralis meestal wordt getraind tijdens typische oefeningen (bijvoorbeeld kraakpanden, sprongen), of over het algemeen wordt gebruikt voor de sport (bijvoorbeeld hardlopen, fietsen). Deze afzonderlijke trainingservaringen uit de buurt van het doel van de studie kunnen spieraanpassingen veroorzaken die spiermechanica, architectuur en fysiologie zodanig veranderen dat het moeilijk of onmogelijk is om het ware effect van het experimentele protocol van de studie op spiereigenschappen te kennen. Voor dit soort studies, zou het ideaal zijn om een doelspier die vaak niet de focus van de opleiding regimenten te selecteren. De musculus tibialis anterior (TA) is een ideale doelspier die voldoet aan de bovenstaande eisen. Daarnaast kunnen trainingsinterventies op de TA worden gericht met behulp van controleerbare benaderingen, zoals bij het gebruik van een dynamometer. Er is bijna geen trainingsmateriaal met betrekking tot een TA spierbiopsie. Daarom ontwikkelden we een aangepast protocol om relatief onbeschadigde spierbiopten uit de TA te verzamelen.

Protocol

OPMERKING: Hieronder schetsen we een protocol om mechanisch onbeschadigde vezels te oogsten van de TA van vrijwilligers die waren ingeschreven in een apart lopend onderzoek. Dit protocol is vergelijkbaar met dat beschreven door Shanely et al.3, die hebben beschreven de gewijzigde Bergström techniek in vastus lateralis. De hier gepresenteerde informatie is verfijnd door onze onderzoeksgroep, maar is mogelijk niet ideaal voor alle labgroepen of organisatieopstellingen. We geven alleen richtlijnen, …

Representative Results

De hele tijd inzet voor een deelnemer was ongeveer een uur (10 min overleg, 10 min echografie, 20 min chirurgie voorbereiding en verdoving toediening, 10 min chirurgie, en 10 min herstel). Vaak activeerden deelnemers onbewust hun TA en hadden ze consistente herinneringen nodig om de spier zo ontspannen mogelijk te houden. Wanneer de biopsienaald in de spier zat, meldden deelnemers meestal een uniek “druk”-gevoel in het gebied rond de biopsienaald, met af en toe perioden van matig tot intens ongemak. Eens, een deelnemer t…

Discussion

In dit rapport beschreven we een techniek voor de biopsie van structureel onbeschadigd spierweefsel van TA. We vonden dat deze procedure een aanvaardbaar gehalte van bruikbare spiervezels (5-10 vezel bundel preparaten per 50 mg verzameld weefsel) voor mechanische testen oplevert. Verder hadden we genoeg weefsel voor de follow-up mechanische, genetische en proteomische experimenten.

Er zijn verschillende methoden die meestal worden gebruikt voor het verzamelen van spierbiopten^…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction