이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.
신경의 지정 가능한 세트의 활동이 빛으로 기록되고 조작될 수 있는 형질 전환 무척추 동물 제제의 발달은 행동의 신경 기초의 연구를 위한 혁명적인 진보를 나타냅니다. 그러나, 이 발달의 단점은 아주 소수의 “디자이너” 유기체(예를 들어, C. elegans 및 Drosophila)에조사관을 집중하는 경향이 있습니다, 잠재적으로 네트워크 기능의 일반적인 원리를 확인하는 데 필요한 많은 종에 걸쳐 비교 연구의 추구에 부정적인 영향을 미칩니다. 본 기사는 비트랜스제식 위산염 종의 뇌에서 전압에 민감한 염료를 사용한 광학 레코딩을 빠르게(즉, 단일 실험의 시간 과정 내에)에 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여 준다. 우리는 우리의 실험실에서 활동 잠재적인 흔적을 얻기 위해 우리의 실험실에서 사용 하는 해부, 염색 및 기록 방법을 자세히 설명 하 고 수십 ~150 신경 과학에 새로운 하나를 포함 하 여 여러 위장 종의 CNS에서 행동 관련 모터 프로그램 동안 뉴런에 150 뉴런- nudibranch Berghia 스테파니. 이미징은 흡광전압 에민감한 염료와 1,600프레임/초로 샘플링하는 464요소 포토다이오드 어레이로 수행되며, 기록된 뉴런에서 생성된 모든 작용 잠재력을 캡처할 수 있을 만큼 빠릅니다. 여러 분 기록은 거의 또는 전혀 신호 표백 또는 광독성과 준비 당 얻을 수 있습니다. 설명된 방법을 통해 수집된 원시 광학 데이터는 다양한 예시 방법을 통해 이후에 분석될 수 있다. 당사의 광학 기록 접근 방식은 다양한 비트랜스제닉 종에서 네트워크 활동을 조사하는 데 쉽게 사용할 수 있으므로 뇌가 어떻게 행동을 생성하는지에 대한 비교 연구에 적합합니다.
Drosophila와 C. elegans와 같은 무척추 동물의 형질 전환선의 발달은 행동의 신경 기지가 광학적으로 심문되고 조작될 수 있는 강력한 시스템을 제공하고 있습니다. 그러나, 이러한 특별 한 준비 비 트랜스 원 종의 신경 회로 연구에 대 한 열정을 감소의 단점이 있을 수 있습니다., 특히 신경 과학 연구에 새로운 종의 도입에 관한. 비교 연구는 이러한 원리가1,2,3,4를발견하는 필수 경로를 나타내기 때문에 하나 또는 두 개의 모델 시스템에만 초점을 맞추는 것은 네트워크 기능의 일반적인 원칙을 찾는 데 해롭습니다. 우리의 목표는 신경망 기능의 비교 연구를 촉진하기 위한 노력의 일환으로 위트포드 신경망의 기능 구조에 대한 신속한 통찰력을 얻기 위한 대규모 이미징 접근법을 입증하는 것입니다.
Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea 등과 같은 위장 용 연체 동물은 오랫동안 신경망 기능의 원리를 조사하는 데 사용되어 왔으며, 그 행동은 신경리아 표면에 위치한 크고 종종 개별적으로 식별 가능한 뉴런으로 중재되기 때문에5가지 기록 기술에 쉽게 접근 할 수 있습니다. 1970년대에 플라즈마 멤브레인에 통합할 수 있는 전압 에민감한 염료(VSDs)가 개발되어 곧 여러 뉴런6에의해 생성된 작용 잠재력의 첫 번째 전극 없는 기록을 가능하게 하였다. 여기에서, 우리는 신경 과학, Berghia 스테파니에새로운 것을 포함하여 위장의 몇몇 종의 네트워크 활동을 검토하기 위하여 VSDs의 우리의 사용을 보여줍니다. 이미징 장치는 1,600프레임/초(그림1)에서샘플링하는 시판되는 464요소 포토다이오드 어레이(PDA)로, 빠른 흡광도 VSD로 사용될 경우 기록된 모든 뉴런7의작용 잠재력을 드러낸다. 모든 다이오드에 의해 기록된 신호는 PDA 획득 소프트웨어에서 신경절 의 이미지에 획득 하고 중첩된 직후에 표시되므로 동일한 준비8,9에서날카로운 전극으로 관심 있는 뉴런을 조사할 수 있게 된다.
원시 PDA 데이터에서 많은 다이오드는 더 큰 뉴런을 중복적으로 기록하고 있으며, 많은 다이오드는 또한 여러 뉴런의 혼합 신호를 포함합니다. 전환점은 독립적 인 구성 요소 분석을 사용하여 각 원시 464 채널 PDA 데이터 세트를 새로운 추적 세트로 신속하게 처리하기 위해 자동화 된 스파이크 정렬 방법을 개발하여 모든 기록 된 뉴런이 작업 잠재력10,11을포함하는 별도의 추적에 나타납니다.
이 문서에서는 포토다이오드 어레이와 빠른 흡광도 VSD를 통해 위장 신경계에서 대규모 액션 잠재적 기록을 얻는 데 관련된 필수적인 단계를 설명합니다. 또한, 광학적으로 기록된 뉴런을 군집화및 매핑하고, 발사흔적(12,13)의간단한 검사를 통해 흔히 명백하지 않은 인구 수준의 특징을 특성화하기 위해 사용될 수 있는 분석 방법을 설명한다.
대규모 VSD 이미징 접근 방식을 구현하는 데 있어 가장 중요한 세부 사항 중 하나는 다이오드 를 가로질러 대비 가장자리의 움직임을 생성하는 진동을 최소화하여 큰 관절 신호를 생성하는 것입니다. 흡광도 VSD는 작용 잠재력을 가진 빛 강도의 매우 작은 비율의 변화를 일으키기 때문에 진동 아티팩트는 방지되지 않으면 관심있는 신경 신호를 가릴 수 있습니다. 진동 아티팩트를 최소화하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다. 첫째, 이미징 룸은 1층에 위치하고 있으며, 공기 취급 장비 및 기타 여러 소스 구축과 관련된 진동으로 준비를 격리합니다. 둘째, 스프링 기반 격리 테이블이 사용되었으며, 다른 PDA 사용자가 확인한 결과 일반적인 에어테이블(16)보다진동이 더 잘 완화되는 것을 확인했습니다. 셋째, 수면 침수 목표가 사용되어 표면 파문으로 인한 이미지 변동을 제거했습니다. 넷째, 이미지화되는 준비는 실리콘 플러그 나 석유 젤리에 의해 제자리에 유지되는 위에서 아래로 눌러 챔버 커버 슬립 바닥과 커버 슬립 조각 사이에 가볍게 눌러 준비를 안정화했다. 이것은 또한 심리온 또는 신경정수의 볼록한 표면을 평평하게 하고, 객관적인 초점의 평면에 있는 더 많은 뉴런의 결과로, 기록된 신경의 수를 증가시킵니다.
작용 전위로부터 발생하는 VSD 광 흡수도의 매우 작은 변화에 대한 신호 대 잡음 비율을 최대화하려면 PDA에 대한 준비를 통해 거의 포화 광을 달성하는 동시에 염료의 광표백을 최소화하는 것이 필수적입니다. 이를 위해, 우리는 일반적으로 1x 위치에서 PDA 제어패널 게인 스위치로 측정된 바와 같이 3-4 V의 휴식 광 강도에서 작동합니다(PDA의 464 증폭기는 빛의 10V에서 포화). 데이터 수집 중에 이 게인 계수가 100배로 변경됩니다. PDA에 의해 측정된 바와 같이 3-4 V에 도달하기에 충분한 빛을 얻는 것은 여러 가지 방법으로 달성될 수 있다. 먼저, 사용 중 흡수성 염료의 흡수 특성에 적합한 파장을 제공하는 초브라이트 LED 광원을 사용한다. 이에 따라 735-nm LED 콜리메이트 램프가 사용되었으며, 이는 RH155 및 RH482의 최적의 흡수 파장과 겹친다. 둘째, 필요한 경우 LED 광원에서 더 작은 영역으로 빛을 집중시키는 플립탑 하위 스테이지 응축기를 사용합니다. 셋째, 응축기 높이를 조정하여 Köhler 조명을 달성하여 높고 균일한 밝기와 최대화 품질을 보장합니다. 넷째, 광학 경로에 열 필터가 없는지 확인하여 LED 램프의 735-nm 파장을 감쇠시킬 수 있습니다. 다섯째, 광학 경로에서 더 많은 빛이 필요한 경우 디퓨저를 제거합니다. 여섯째, 높은 공간 해상도를 제공하는 고-NA 목표를 사용하고, 낮은 램프 강도에서 PDA에 충분한 수준의 빛이 도달할 수 있도록 한다. 이를 통해 모든 파일에 걸쳐 동일한 광 강도를 사용하여 신호 진폭을 크게 잃거나 다시 염색할 필요가 없는 준비당 10-20분의 여러 수집 파일을 얻을 수 있는 범위내에서 광표백을 최소화할 수 있었습니다. 결정적으로, 실험자가 이러한 긴 파일을 통해 뉴런을 추적하려는 경우 초점 평면이 변경되지 않고 준비가 이동하지 않도록합니다. 마지막으로, PDA에 충분한 빛을 라우팅하는 추가 방법은 더 얇고 불투명한 간질증이 적은 젊은 동물을 사용하는 것입니다.
때때로 우리는 광학 신호의 신호 대 잡음 비율이 저하되고 모터 프로그램 리듬이 최적이 아님을 발견합니다(예: 느리거나 비정상적). 이 지속적으로 발생 하기 시작 하는 경우, 우리는 VSD의 신선한 솔루션을 혼합. VSD의 알리쿼트들은 일반적으로 -20°C 냉동고에서 약 6개월 동안 유효하다. 이와 관련, 베르히아의경우 지금까지 가장 좋은 결과를 흡광도 VSD RH482로 얻을 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. RH482는 RH155보다 더 많은 리포필성이기 때문에 베르히아의비교적 작은 뉴런을 더 잘 얼룩지게 하거나 이 열대 종에 사용되는 더 높은 기록식염수 온도에서 뉴런 멤브레인에 더 효과적으로 남아 있을 수 있습니다.
신경 활동의 PDA 기반 이미징의 한 가지 제한은 100x 사전 증폭 단계 전에 하드웨어에서 전압 신호의 AC 커플링과 관련이 있습니다: 이것은 이 기술에 필요한 높은 휴식 광 수준에 의해 생성된 큰 DC 오프셋을 제거하는 데 필요한 기능을 나타내지만, PDA에 대한 AC 커플링 본질은 멤브레인의 느린 변화의 측정을 배제합니다. 시냅스 입력과 관련된 것과 같은. 기록 속도가 느리거나 정상 상태 인 잠재적 인 변화가 필요한 경우 DC 결합 CMOS 카메라 이미징 시스템을 사용하여 하위 임계 값 활성을 캡처할 수 있습니다. Byrne과 동료들은 최근 RH155와 이러한 설정을 사용하여 Aplysia17,18의부칼 신경절에서 뉴런의 활성을 이미지화했다. 우리는 두 시스템을 모두 사용하고 CMOS 카메라, 때문에 검출기의 훨씬 높은 밀도 (128 x 128), 동일한 이미징 시간7에대한 50 배 더 큰 데이터 파일을 생성발견. PDA의 작은 파일은 더 빠른 처리 및 분석을 용이하게합니다. 또한 확장된 단일 평가판기록(그림 4)과학습 연구를 통해 여러 시험의 데이터가 스파이크 정렬 전에 하나의 큰 파일로 연결되어 학습이19로진행됨에 따라 네트워크 조직을 추적할 수 있습니다.
다른 카메라 기반 조사에서, 형광 VSDs는 거머리의 세그먼트 간질에서 네트워크 기능을 검사하기 위해 크리스탄과 동료에 의해 사용되었습니다. 한 가지 영향력 있는 연구에서 이것은 수영하거나20을기어 다니는 동물의 결정에 관련된 뉴런의 식별으로 이어졌습니다. 또 다른 연구에서는, 크리스탄 외. 거머리의 수영 및 크롤링 동작이 다기능 대 전용 회로21에의해 구동되는 정도를 조사했다. 최근에, Wagenaar와 동료는 거머리 세그먼트 신경절에 있는 거의 모든 뉴런에서 기록할 수 있는 전압 화상 진찰을 위한 양면 현미경을 이용했습니다22. 많은 카메라 기반 이미징 방법과 는 달리 PDA 기반 이미징 방법의 장점은 결과 처리를 위한 신경 경계에 대한 결정을 포함하지 않는 블라인드 소스 분리의 한 형태인 ICA에 의한 신속하고 편견없는 스파이크 정렬입니다.
VSD의 선택에 대하여, 흡광도 염료 RH155 및 RH482의 한 가지 장점은 그들과 관련된 거의 -투 -no 광독성이며,23,24,형광 VSDs에 대한 일반적인 것보다 더 긴 기록 시간을 가능하게. 또한, 우리가 사용하는 빠른 흡광도 VSD는 일반적으로 진폭80mV인 위장 제제에서 과다 촬영 체세포 작용 잠재력을 기록하는 데 적합합니다. 그림 3G에표시된 바와 같이, 우리의 광학 방법은 작업 잠재력 언더슈트를 기록할 수 있습니다 (우리의 기록 중 어느 것도 추적 평균되지 않음) 이것은 우리가 사용하는 VSD가 어느 정도 감쇠되어 소마에 도달 할 때까지 오버슈팅되지 않는 다른 모델 시스템에서 작업 잠재력을 분별 할 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 광학 접근 은 soma에 기록 될 때 매우 감쇠 된 행동 잠재력을 나타내는 것으로 알려져 있는 종에 대 한 이상적이지 않을 수 있습니다.
신경망에 대한 많은 현재 연구는 디자이너 형질 전환 종의 소수에 초점을 맞추고있다. 그러나, 신경 과학 은 다양 한 phylogenetically 구별 된 종의 연구에서 혜택. 다양한 종을연구하면 회로가25, 26으로어떻게 진화하는지에 대한 통찰력을 제공하고 필라1,2,3,4,27에서공통될 수 있는 네트워크 기능의 원리를 조명합니다. 우리는 지금까지 압리시아 칼리포니카8,11,12,13,14,28, 트리토니아 디오메데아8,9,11, 14,19,28, 트리토니아 축제28을포함한 다수의 위장 종에 이미징 방법을 적용했습니다. Pleurobranchaea californica (게시되지 않은 데이터), 그리고 가장 최근의 베르디아 스테파니 (그림 5). 이 접근법의 매력은 형질 전환 동물이 필요없이 많은 종에 쉽게 적용 할 수 있다는 것입니다. 우리는 빠른 흡광성 염료와 PDA를 가진 VSD 화상 진찰의 우리의 사용이 반 온전하, 행동 Navanax29 및 Aplysia30 준비에서 이것을 성취한 선구적인 일의 발자취를 따른다는 것을 인정하고 싶습니다. 우리의 접근 방식의 급속성에 우리의 강조는 부분적으로 많은 조사자가 신경과학31에광범위한 관심의 과학적 질문을 탐구하기 전에 연구의 년이 기본 네트워크 조직을 특성화하는 데 필요한 것이라는 두려움으로 인해 새로운 종에 네트워크 연구를 시작하는 것을 점점 꺼릴 수 있다는 우려에 대한 답변입니다. 따라서, 여기서 우리의 목표는 프로세스를 크게 가속화하는 기술을 보여주는 것입니다 – 네트워크 조직에 대한 중요한 당일 통찰력이 단일 준비에서 얻을 수 있다는 점에 이르기까지.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NSF 1257923 NIH 1U01NS10837에 의해 지원되었습니다. 저자는 실험실에서 장 왕의 도움을 인정하고 자합니다.
Achromat 0.9 NA swing condenser | Nikon | N/A | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 with SC-20 | Controls perfusion saline temperature |
Chamber thermometer | Physitemp | BAT-12 with IT-18 microprobe | |
Digital camera | Optronics | S97808 | |
Dissecting forceps | Dumont | #5 | |
Dissecting scissors | American Diagnostic Corp. | ADC-3410Q | |
Imaging microscope | Olympus | BX51WIF | |
Imaging perfusion chamber | Siskiyou | PC-H | |
Instant Ocean | Instant Ocean | SS6-25 | Makes 25 gallons at a time |
Master-8 pulse stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
Microdispenser | Drummond Scientific | 3-000-752 | Dye applicator for pressure staining |
Microdissection scissors | Moria | 15371-92 | |
Minutien pins (0.1 mm) | Fine Science Tools | NC9677548 | For positioning and stabilizing CNS |
Motorized microscope platform | Thorlabs | GHB-BX | Gibraltar platform |
NeuroPlex imaging software | RedShirtImaging | NeuroPlex | Compatible with the WuTech photodiode array |
Objective lenses | Olympus | XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340 | |
PE-100 polyethylene tubing | VWR | 63018-726 | Tubing to make suction electrodes |
Perfusion pump | Instech | P720 with DBS062SDBSU tube set | |
Petroleum jelly | Equate | NDC 49035-038-54 | |
Photodiode array with control panel | WuTech Instruments | 469-IV photodiode array | Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information |
RH155 | Santa Cruz Biotechnology | sc-499432 | Voltage-sensitive dye |
RH482 | Univ of Conn. Health Center | JPW-1132 | Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow |
Silicone earplugs | Mack's | Model 7 | To be use for preparation compression |
Staining PE tubing | VWR | 63018-xxx | Different sizes depending on fit |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
Thorlabs LED and driver | Thorlabs | M735L2-C1, DC2100 | LED lamp and driver |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 14-171-xxx | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | MK26 | Spring-based |