Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas
Summary
Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.
Abstract
O fenótipo celular pode ser invertido ou modificado com diferentes métodos, com vantagens e limitações específicas para cada técnica. Aqui descrevemos uma nova estratégia que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. Dois passos principais são necessários. Na primeira etapa, as células adultas maduras (terminantemente diferenciadas) são expostas à borracha epigenética 5-aza-cytidina para levá-las a um estado pluripotente. Esta parte do protocolo foi desenvolvida, com base na compreensão crescente dos mecanismos epigenéticos que controlam o destino e a diferenciação celular, e envolve o uso do modificador epigenético para apagar o estado diferenciado celular e, em seguida, dirigir para uma janela transitória de alta plasticidade.
Na segunda etapa, as células apagadas são encapsuladas em micro-bioreatores de politetrafluoroetileno (PTFE), também conhecidos como Mármores Líquidos, para promover o rearranjo celular 3D para estender e manter a alta plasticidade adquirida. O PTFE é um composto sintético hidrofóbico não reativo e seu uso permite a criação de um microambiente celular, que não pode ser alcançado em sistemas tradicionais de cultura 2D. Este sistema incentiva e aumenta a manutenção da pluripotência, embora as pistas relacionadas à bio-mecanosensing.
Os procedimentos técnicos aqui descritos são estratégias simples para permitir a indução e manutenção de um estado de alta plasticidade em células somáticas adultas. O protocolo permitiu a derivação de células de alta plasticidade em todas as espécies de mamíferos testadas. Uma vez que não envolve o uso de transfecção genética e é livre de vetores virais, pode representar um notável avanço tecnológico para aplicações de medicina translacional. Além disso, o sistema micro-bioreator fornece um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco, recriando in vitro um microambixo específico que permite a cultura de longo prazo de células de alta plasticidade, ou seja, como ESCs, iPSCs, células epigeneticamente apagadas e MSCs.
Introduction
Durante as últimas décadas, o conceito amplamente aceito de progressão unidirecional em direção ao comprometimento e diferenciação celular foi completamente revisto. Foi demonstrado que a especificação celular pode ser revertida, e uma célula terminantemente diferenciada pode ser empurrada para um estado permissivo menos comprometido e mais alto, usando diferentes métodos.
Entre os vários métodos propostos, um dos métodos mais promissores envolve o uso de compostos químicos para induzir células em uma chamada pluripotência quimicamente induzida. As pequenas moléculas utilizadas nesta abordagem são capazes de interagir e modificar a assinatura epigenética de uma célula adulta madura, evitando a necessidade de qualquer vetor transgênico e/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Inúmeros estudos têm mostrado recentemente que é possível mudar as células de um fenótipo para outro, fornecendo estímulos bioquímicos e biológicos específicos que induzem a reativação de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Esses eventos de desmetilação permitem a conversão de células terminais diferenciadas em um progenitor primitivo, um multipotente ou uma célula de alta plasticidade/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Paralelamente, muitos estudos têm se concentrado recentemente na compreensão de pistas relacionadas à mecanosensagem e, mais especificamente, na possibilidade de usar forças mecânicas para influenciar diretamente a plasticidade celular e/ou diferenciação 16,17,18,19. De fato, foi claramente demonstrado que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel fundamental no controle do destino celular. Em particular, os sinais biomecânicos e biofísicos produzidos pelo ECM regulam diretamente mecanismos moleculares e vias de sinalização, influenciando o comportamento celular e funções20,21. Esses dados recentes abriram caminho para o desenvolvimento de novos sistemas de cultura 3D que imitam mais de perto o microambiente de células in vivo, replicando estímulos mecânicos e físicos impulsionando o comportamento celular.
Descrevemos aqui um protocolo de duas etapas que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. No primeiro passo, as células são incubadas com a molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente é capaz de induzir uma significativa desmetilação global de DNA através de um efeito combinado da translocação direta 2 (TET2)-mediada ação 8,10 e a inibição indireta das metiltransferases de DNA (DNMT)22,23. Esta etapa induz a remoção dos blocos epigenéticos com uma posterior reativação da expressão genética relacionada à pluripotency e, portanto, a geração de células de alta plasticidade 1,2,3,8,10, a partir de agora referidas como “células apagadas epigenéticas”. Na segunda etapa, as células são encapsuladas em um sistema de cultura 3D. Para isso, o composto sintético hidrofóbico não reativo politetrafluoroetileno (PTFE; com tamanho de partícula de 1 μm) é usado como micro-bioreator, que permite a criação de um microambiente celular inalcançável através do uso de sistemas tradicionais de cultura 2D10. As partículas de pó PTFE aderem à superfície da gota líquida na qual as células são re-suspensas e isolam o núcleo líquido da superfície de suporte, permitindo a troca de gás entre o líquido interior e o ambiente circundante24. O “micro-bioreator PTFE” obtido, também conhecido como “Mármore Líquido”, incentiva as células a interagir livremente entre si, promovendo o rearranjo de células 3D 25,26,27, e estende e mantém de forma estável o estado de alta plasticidade adquirido, embora a sinalização relacionada à bio-mecanosensing 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante as últimas décadas, diversos estudos se concentraram no desenvolvimento de estratégias para reverter uma célula terminalmente diferenciada para um estado permissivo menos comprometido e maior. O protocolo aqui descrito permite a geração e manutenção a longo prazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras terminais diferenciadas. O método combina duas etapas independentes que envolvem a indução de um estado permissivo elevado que é alcançado através de apagamento epigenético qu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e pelo MiND Foods Hub ID: 1176436. Todos os autores são membros do COST Action CA16119 In vitro 3D total cell guidance and fitness (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
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