자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰
Summary
생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
자유롭게 움직이는 동물에서 신경 활동의 생체 내 실시간 모니터링은 행동에 신경 활동을 연결하는 주요 접근 법 중 하나입니다. 이를 위해, 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs), 소형형 형광 현미경, 그라데이션 굴절지수(GRIN) 렌즈를 사용하여 뉴런의 칼슘 과도를 검출하는 생체 내 이미징 기술이 개발되어 많은 뇌 구조1,2,3,4,5,6에성공적으로 적용되었다. 이 화상 진찰 기술은 최대 몇 주까지 장기 기간 동안 유전으로 정의된 세포 집단의 만성 동시 화상 진찰을 가능하게 하기 때문에 특히 강력합니다. 유용하지만, 이 화상 진찰 기술은 편도체, 정서적 처리 및 연관 공포 기억 기억7을위한 필수적인 두뇌 구조물과 같은 두뇌 내깊은 찾아내는 두뇌 구조물에 쉽게 적용되지 않았습니다. 편도체에 이미징 기술을 적용하는 것을 어렵게 만드는 몇몇 요인이 있습니다. 예를 들면, 운동 유물은 일반적으로 두뇌에 있는 깊은 이식된 헤드 마운트 현미경이 상대적으로 불안정하기 때문에 더 깊은 두뇌 지구에서 실시하는 화상 진찰 도중 더 빈번해 깁니다. 또 다른 문제는 측면 심실이 이식된 GRIN 렌즈에 가깝게 위치하고 호흡 도중의 움직임이 쉽게 교정할 수 없는 고불규칙한 동작 아티팩트를 유발할 수 있어 안정적인 이미징 뷰를 형성하기가 어렵다는 것입니다. 더욱이, 편도체내의 세포는 일반적으로 휴식 또는 마취 상태에서 조용하기 때문에, 나중에 이미징을 위한 기질도금 절차 도중 편도체에서 GECI를 발현하는 표적 세포를 찾아 서 집중하기 어렵다. 이 프로토콜은 이러한 깊은 뇌 영역에서 생체 내 칼슘 이미징을 성공적으로 위해 헤드 마운트 소형 현미경으로 편도체에서 GECI를 발현하는 세포를 효율적으로 표적으로 하는 방법에 대한 유용한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 제한되지는 않습니다.
Introduction
칼슘은 거의 모든 세포 기능8에서중요한 역할을하는 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 뉴런에서, 작용 잠재력 발사 및 시냅스 입력은 세포내 무료 [Ca2+]9,10의급격한 변화를 일으킨다. 따라서 칼슘 과도를 추적하면 신경 활동을 모니터링 할 수있는 기회를 제공합니다. GECI는 정의된 세포 인구 및 셀룰러 내구획(11,12)에서[Ca2+]모니터링을 허용하는 강력한 도구입니다. 단백질 기반 칼슘 표시기의 많은 다른 모형 중, GCaMP, 단일 GFP 분자13에근거를 둔 Ca2+ 프로브는, 가장 최적화되고 이렇게 널리 사용되는 GECI입니다. 여러 차례의 엔지니어링을 통해 GCaMP의 여러 변형이12,14,15,16을개발했습니다. 우리는 이 프로토콜16에서최근에 개발된 GCaMPPs, GCaMP7b 중 하나를 사용합니다. GCaMP센서는 개발 17 동안 Ca2+ 과도의 이미징, 특정 피질층(18)에서의생체 이미징, 모터 작업 학습19의 회로 역학 측정 및 해마및 대미20의 연관 공포 기억과 관련된 세포 앙상블 활동의이미징과 같은 다수의 모델 유기체에서 신경 회로 기능의 연구에 크게기여했다.
GECIs의 광학 이미징은 몇 가지 장점이있습니다 22. 유전 인코딩을 통해 GECI는 유전자 프로파일 또는 해부학 적 연결의 특정 패턴에 의해 정의되는 세포의 특정 하위 집합에서 장기간 안정적으로 표현 될 수 있습니다. 광학 이미징은 살아있는 동물에서 수백에서 수천 개의 뉴런을 생체 내에서 만성 동시 모니터링할 수 있게 합니다. 몇몇 광학 이미징 시스템은 헤드 마운트 소형형 광소 현미경21,23,24,25로마우스를 자유롭게 행동하는 뇌 내에서 GECIs의 생체 이미징 및 분석을 위해 개발되었다. GECIs, GRIN 렌즈 및 헤드 마운트 소형 현미경을 기반으로 한 생체 내 광학 이미징 기술이 신경 회로 활동과 행동 사이의 연관성을 연구하는 강력한 도구임에도 불구하고, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 GRIN 렌즈를 미막도라에서 GEC를 표현하는 세포에 표적화하는 것과 관련된 몇 가지 기술적 문제로 인해 어려웠으며, 이는 GEC의 이미지를 심각하게 저하시키는 동작 아티팩트를 유발하고 이미지를 저하시키는 데 방해가 되고 있다. 이 프로토콜은 편도체에서 생체 내 광학 칼슘 이미징에서 성공적인 단계를 위한 중요한 단계인 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 외과 적 절차에 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 편도체를 대상으로하지만, 여기에 설명 된 대부분의 절차는 일반적으로 다른 깊은 뇌 영역에 적용됩니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 다른 대체 시스템에서동일한 목적을 쉽게 달성할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
숙련된 수술 기술은 우리가 여기에서 설명한 편도체와 같은 더 깊은 두뇌 지구에 있는 헤드 마운트 소형 현미경 검사법을 가진 생체 내 광학 칼슘 화상 진찰에서 성공을 달성하기 위해 필수적입니다. 따라서 이 프로토콜은 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 최적화된 수술 과정에 대한 지침을 제공하지만 중요한 단계에 추가 최적화 프로세스가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 섹션에서 언급?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 삼성과학기술재단(프로젝트 번호 SSTF-BA1801-10)의 보조금으로 지원되었다.
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
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