Agrobacterium-Gemedieerde genetische transformatie, transgene productie, en de toepassing ervan voor de studie van mannelijke reproductieve ontwikkeling in rijst
Summary
Dit werk beschrijft het gebruik van CRISPR-Cas9 genoombewerkingstechnologie om het endogene gen OsABCG15 uit te sluiten, gevolgd door een gemodificeerd Agrobacterium-gemedieerdtransformatieprotocol om een stabiele mansteriele lijn in rijst te produceren.
Abstract
Mannelijke steriliteit is een belangrijke agronomische eigenschap voor hybride zaadproductie die meestal wordt gekenmerkt door functionele defecten in mannelijke voortplantingsorganen / gameten. Recente ontwikkelingen in CRISPR-Cas9 genoombewerkingstechnologie zorgen voor een hoge bewerkingseffectie en tijdbesparende knock-out mutaties van endogene kandidaat-genen op specifieke locaties. Bovendien, Agrobacterium-bemiddelde genetische transformatie van rijst is ook een belangrijke methode voor genmodificatie, die op grote schaal is overgenomen door vele openbare en particuliere laboratoria. In deze studie hebben we CRISPR-Cas9 genoombewerkingstools toegepast en met succes drie mannelijke steriele mutantlijnen gegenereerd door gerichte genoombewerking van OsABCG15 in een japonica cultivar. We gebruikten een gemodificeerde Agrobacterium-gemedieerderijst transformatie methode die uitstekende middelen van genetische emasculatie voor hybride zaadproductie in rijst zou kunnen bieden. Transgene planten kunnen worden verkregen binnen 2-3 maanden en homozygoottransgeefmiddelen werden gescreend door genotyperen met behulp van PCR-versterking en Sanger sequencing. Fundamentele fenotypische karakterisering van de mannelijke steriele homozygootlijn werd uitgevoerd door microscopische observatie van de rijst mannelijke voortplantingsorganen, pollen levensvatbaarheid analyse door jodium kalium jodide (I2-KI) vlekken semi-dunne dwarsdoorsnede van de ontwikkeling van anthers.
Introduction
Rijst is het belangrijkste voedselgewas, met name in ontwikkelingslanden, en is een basisvoedsel voor meer dan de helft van de wereldbevolking. Over het geheel genomen groeit de vraag naar rijstkorrels en zal de vraag naar rijstkorrels naar verwachting met 50% toenemen in 2030 en 100% in 20501,2. Toekomstige verbeteringen in de rijstopbrengst zullen moeten profiteren van diverse moleculaire en genetische hulpbronnen die rijst een uitstekend model maken voor monocotyledonous plantonderzoek. Deze omvatten een efficiënt transformatiesysteem, geavanceerde moleculaire kaart en openbaar toegankelijke database van uitgedrukte sequentietags, die gedurende vele jaren3,4zijn gegenereerd . Een strategie om de gewasopbrengst te verbeteren is hybride zaadproductie5, waarvan een centraal element de mogelijkheid is om de mannelijke vruchtbaarheid te manipuleren. Inzicht in de moleculaire controle van de mannelijke vruchtbaarheid in graangewassen kan helpen om belangrijke kennis te vertalen naar praktische technieken om de hybride zaadproductie te verbeteren en de productiviteit van gewassen te verbeteren6,7.
Genetische transformatie is een belangrijk instrument voor fundamenteel onderzoek en commerciële landbouw, omdat het de introductie van vreemde genen of manipulatie van endogene genen in gewasplanten mogelijk maakt, en resulteert in het genereren van genetisch gemodificeerde lijnen. Een passend transformatieprotocol kan helpen om genetische en moleculaire biologiestudies te versnellen voor een fundamenteel begrip van genregulatie8. Bij bacteriën vindt genetische transformatie op natuurlijke wijze plaats; echter, in planten, het wordt kunstmatig uitgevoerd met behulp van moleculaire biologie technieken9,10. Agrobacterium tumefaciens is een door de bodem overgedragen, Gram-negatieve bacterie die kroongalziekte in planten veroorzaakt door T-DNA, een gebied van zijn Ti plasmid, via een type IV-afscheidingssysteem11,12over te brengen. In planten wordt A. tumefaciens-gemedieerdetransformatie beschouwd als een wijdverbreide methode voor genmodificatie omdat het leidt tot stabiele en lage integratie van het kopienummer van T-DNA in het gastheergenoom13. Transgene rijst werd voor het eerst gegenereerd door Agrobacterium-gemedieerdegen transformatie in het midden van de jaren 1990 in de japonica cultivar14. Met behulp van dit protocol werden verschillende transgene lijnen verkregen binnen een periode van 4 maanden met een transformatie-efficiëntie van 10%-30%. De studie gaf aan dat er twee kritieke stappen zijn voor de succesvolle transformatie: een daarvan is de inductie van embryoneieke callus uit volwassen zaden en een andere is de toevoeging van acetosyringone, een fenolische verbinding, aan de bacteriële cultuur tijdens de co-teelt, wat een hogere transformatie-efficiëntie in planten14,15mogelijk maakt . Dit protocol is op grote schaal gebruikt met kleine wijzigingen in japonica16,17,18,19 evenals andere cultivars zoals indica20,21,22,23 en tropische japonica24,25. Inderdaad, meer dan 80% van de artikelen waarin rijsttransformatie wordt beschreven, gebruikt Agrobacterium-gemedieerdegentransformatie als hulpmiddel13. Tot op heden zijn verschillende protocollen voor genetische transformatie ontwikkeld met behulp van rijstzaad als uitgangsmateriaal voor callusinductie16,17,18,19. Er is echter weinig bekend over jonge bloeiwijze als explants voor de productie van kalelt. Over het algemeen is het belangrijk om een snel, reproduceerbaar en efficiënt protocol voor gentransformatie en regeneratie vast te stellen voor functionele genomics en studies over gewasverbetering.
In de afgelopen jaren heeft de vooruitgang van crispr-Cas9-technologie geresulteerd in een nauwkeurig genoombewerkingsmechanisme om de genfunctie te begrijpen en agronomisch belangrijke verbeteringen te leveren voor plantenveredeling26,27. CRISPR biedt ook een aanzienlijke belofte voor de manipulatie van mannelijke reproductieve ontwikkeling en hybride productie. In deze studie gebruikten we een gen knock-out systeem met crispr-Cas9 technologie en koppelden het aan een efficiënt rijstgentransformatieprotocol met behulp van jonge bloeiwijzen als explants, waardoor stabiele mannelijke steriele lijnen werden gemaakt voor de studie van reproductieve ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kunstmatige geniale mannelijke steriele mutanten worden traditioneel gegenereerd door willekeurige fysische, chemische of biologische mutagenese. Hoewel dit krachtige technieken zijn, slaagt hun willekeurige aard er niet in om op de enorme hoeveelheid moderne genomische kennis te kapitaliseren die het potentieel heeft om op maat gemaakte verbeteringen in moleculaire veredeling32te leveren. Het CRISPR-Cas9-systeem wordt veel gebruikt in planten vanwege de eenvoudige en betaalbare middelen om DNA<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Xiaofei Chen erkennen voor het verstrekken van de jonge rijstbloeseseiten en hulp bij het maken van de rijstweefsel cultuur medium. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
