Detecção quantitativa de sers de ácido úrico através da formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro de Agregados de Nanopartículas de Ouro e Cucurbit[n]uril

Summary

Um complexo hospedeiro-convidado de cucurbit[7]uril e ácido úrico foi formado em uma solução aquosa antes de adicionar uma pequena quantidade em solução Au NP para a espectróscopia raman (SERS) com visão quantitativa de Raman (SERS) com um espectrômetro modular.

Abstract

Este trabalho descreve um método rápido e altamente sensível para a detecção quantitativa de um importante biomarcador, ácido úrico (UA), via espectrescopia raman aumentada pela superfície (SERS) com um baixo limite de detecção de ~0,2 μM para múltiplos picos característicos na região da impressão digital, usando um espectrômetro modular. Este esquema de biosensação é mediado pela complexidade hospedeira-hóspede entre um macrociclo, cucurbit[7]uril (CB7) e UA, e a subsequente formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro do Au NP auto-montado: nanoaggregados CB7. Uma síntese fácil de Au NP de tamanhos desejáveis para substratos SERS também foi realizada com base na abordagem clássica de redução de citratos com uma opção a ser facilitada usando um sintetizador automatizado construído em laboratório. Este protocolo pode ser facilmente estendido à detecção multiplexada de biomarcadores em fluidos corporais para aplicações clínicas.

Introduction

O ácido úrico, que é o produto final do metabolismo de nucleotídeos de purina, é um importante biomarcador no soro sanguíneo e na urina para o diagnóstico de doenças como gota, pré-eclâmpsia, doenças renais, hipertensão, doenças cardiovasculares e diabetes 1,2,3,4,5. Os métodos atuais para detecção de ácido úrico incluem ensaios enzimáticos colorimétricos, cromatografia líquida de alto desempenho e eletroforese capilar, que são demorados, caros e requerem uma preparação amostral sofisticada 6,7,8,9.

A espectroscopia raman aprimorada na superfície é uma técnica promissora para o diagnóstico rotineiro de ponto de cuidado, pois permite a detecção seletiva de biomoléculas através de suas impressões digitais de vibração e oferece inúmeras vantagens como alta sensibilidade, resposta rápida, facilidade de uso e sem preparação ou mínima de amostras. Substratos sers baseados em nanopartículas metálicas nobres (por exemplo, NPs Au) podem aumentar os sinais de Raman das moléculas de analito em 4 a 10 ordens de magnitude¹⁰ através de forte aprimoramento eletromagnético causado pela ressonância de plasmon de superfície¹¹. Os Au NPs de tamanhos sob medida podem ser facilmente sintetizados em oposição à fabricação demorada de nanocompositos metálicos complexos¹², e, portanto, são amplamente utilizados em aplicações biomédicas devido às suas propriedades superiores 13,14,15,16. Apego de moléculas macrocíclicas, cucurbit[n]urils (CBn, onde n = 5-8, 10), na superfície dos NPs Au podem melhorar ainda mais os sinais sers das moléculas de analito, pois as moléculas de CB altamente simétricas e rígidas podem controlar o espaçamento preciso entre os Au NPs e localizar as moléculas de analito no centro ou nas proximidades dos hotspots plasmônicos através da formação de complexos hospedeiros-convidados (Figura 1)^17, 18,19,20. Exemplos anteriores de estudos do SERS utilizando Au NP: CBn nanoagreguras incluem nitroexplosivos, aromáticos policíclicos, diaminostilbena, neurotransmissores e creatinina 21,22,23,24,25, com as medidas sers sendo realizadas em uma cuvette ou carregando uma pequena gota em um portador de amostra personalizado. Este esquema de detecção é particularmente útil para quantificar rapidamente biomarcadores em uma matriz complexa com uma alta reprodutibilidade.

Aqui, um método fácil para formar complexos hospedeiros-convidados de CB7 e um importante biomarcador UA, e quantificar UA com um limite de detecção de 0,2 μM via agregações mediadas por CB7 de Au NPs em mídia aquosa foi demonstrado usando um espectrômetro modular, o que é promissor para aplicações diagnósticas e clínicas.

Protocol

1. Síntese de Au NPs Síntese de sementes de Au através do método turkevich convencional26 Prepare 10 mL de solução HAuCl4 de 25 mM dissolvendo 98,5 mg de HAuCl4· 3H2O precursor com 10 mL de água deionizada em um frasco de vidro.NOTA: Transfira uma pequena quantidade de precursor do HAuCl4 em um barco de pesagem e use uma espátula de plástico em vez de espátula metálica para pesar os cristais porque o precursor HAuCl…

Representative Results

Na síntese de Au NP apresentada, os espectros UV-Vis mostram uma mudança dos picos de LSPR de 521 nm para 529 nm após 10 passos de crescimento (Figura 4A,B) enquanto os dados do DLS mostram uma distribuição de tamanho estreito à medida que o tamanho dos NPs Au aumenta de 25,9 nm para 42,8 nm (Figura 4C,D). Os tamanhos médios de G0, G5 e G10 medidos a partir de imagens TEM (Figura 4E) são de …

Discussion

O método de síntese automatizada descrito no protocolo permite que os Au NPs de tamanhos crescentes sejam reproduzidos. Embora existam alguns elementos que ainda precisam ser realizados manualmente, como a rápida adição de citrato de sódio durante a síntese de sementes e a verificação periódica para garantir que a tubulação PEEK seja segura, este método permite NPs Au de grandes tamanhos (até 40 nm), o que normalmente exigiria múltiplas injeções manuais de HAuCl₄ e citrato de sódio, para ser…

Materials

40 nm gold nanoparticles	NanoComposix	AUCN40-100M	NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube	Corning Falcon	14-432-22	50 mL volume
Cucurbit[7]uril	Lab-made		see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate	Sigma aldrich	520918	≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe	Cole-Parmer	WZ-07945-15	3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter	LuerTight	P-662	360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing	IDEX	1572	360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter	IDEX	WZ-02013-30	Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer	Ocean Optics	QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma aldrich	S4641	ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe	Digi-Sense	WZ-08516-55	Type-K
Syringe pump	Aladdin	ALADDIN2-220	2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer	Digi-Sense	WZ-20250-91	Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer	Eppendorf	5382000031	With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid	Sigma aldrich	U2625	≥99%, crystalline