Yeni bir antibiyotik modu-of-action açıklaması ilaç bulma sürecinde zor bir görevdir. Burada açıklanan yöntemin amacı ilaç-mikrop etkileşimleri içine ek fikir sağlamak için antibakteriyel profilleme calScreener kullanarak isothermal mikrocalorimetri uygulamasıdır.
Artan antimikrobiyal direnç küresel tehdit nedeniyle, yeni antibiyotikler acilen ihtiyaç vardır. Bu tür yeni bileşiklerin yenilikçi bir kaynağı olarak Myxobacteria doğal ürünleri araştırmak. İşlemdeki bir darboğaz genellikle eylem tarzlarının açıklanmasıdır. Biz son zamanlarda rutin bir profilleme boru hattının bir parçası olarak izomal mikrocalorimetri kurdu. Bu teknoloji toplam bakteriyel metabolik yanıt antibiyotik maruziyetinin etkisini araştırmak için izin verir, biyokütle oluşumundan ayrılmış süreçler de dahil olmak üzere. Daha da önemlisi, bakteriyostatik ve bakterisidal etkiler ölçümler sırasında herhangi bir kullanıcı müdahalesi olmadan kolayca ayırt edilebilir. Ancak, izotermal mikrocalorimetri oldukça yeni bir yaklaşımdır ve bu yöntemi farklı bakteri türlerine uygulamak genellikle uygun ölçüm koşullarının ön değerlendirmesini gerektirir. Bazı bakterilerin bazı referans termogramlar mevcut, büyük ölçüde sonuçların yorumlanmasını kolaylaştıran vardır. Referans veri havuzu sürekli olarak büyürken, metodolojinin gelecekte artan bir etkiye sahip olmasını ve antibiyotik sınıflarının farklılaşmasını sağlayan derinlemesine parmak izi analizlerine olanak sağlamasını bekliyoruz.
Bu yöntemin amacı, yeni antibakteriyel bileşiklerin etki-hareket modu (MoA) profilinde orta iş gücü olarak isothermal mikrokalorimetri (IMC) uygulamaktır. Bu yöntem, bakteriler üzerindeki bileşiklerin aktivitesine ilişkin verileri ortaya çıkarır ve bileşiğin bakterisidal veya bakteriyostatik doğası hakkında bilgi sağlar.
Ortaya çıkan antimikrobiyal direncin yükselişi (AMR) küresel bir sorundur ve bilinen antibiyotikler ile yaygın enfeksiyonların daha az etkili tedavileryol açar1. Ancak, yeni bileşikler ve bilinen antibiyotikler ile birlikte çalışabilir veya birlikte çalışabilir ilaçlar için arama devam etmektedir ve bu çeşitli yaklaşımlar üzerine inşa edilmiştir. Doğal ürünler mevcut ilaç keşif kampanyalarında önemli bir oyuncu ve özellikle anti-enfektif ilaç keşif2. Ancak, antibiyotik gelişimi için yeni kurşun yapıları belirlenmesi uzun ve mali zorlu birsüreçtir 3. Bu nedenle, keşif erken adımları zaten erken bir aşamada en umut verici iskeleler filtre lemek için son derece önemlidir. Doğal ürün ilaç keşfinde ilk adımlar bir bileşiğin yapısını elde etmek, MoA ile birlikte in vitro aktiviteyi belirlemek ve hedef tanımlamayı içerir. Daha fazla gelişmeye uygun olan en başarılı bileşikler, uygun bir aktivite spektrumu (yani, antibakteriyeller durumunda geniş spektrumlu aktivite) ve önceden var olan AMR’nin üstesinden gelinebileceği yeni bir MoA göstermelidir. Umut verici iskeleler sonra genellikle ikincil tahliller taranır, hangi in vivo biyoyararlanım dahil, toksisite, ve metabolizma4. Mali endişelerin yanı sıra, doğal ürün ilaç keşif maliyetleri ve bileşik izolasyon ve arıtma ile ilgili teknik zorluklar ile ilgili daha fazla zorluklarla karşı karşıya, hangi, sırayla, zor keşif sürecinin erken aşamalarında multi-miligram veya hatta gram miktarları elde etmek için yapabilirsiniz5,6. Bu nedenle, yeni bir doğal ürünü klinik öncesi gelişim için erişilebilir hale getirmek için daha fazla yatırım hakkında iyi bilgilendirilmiş bir karar almak için en az bileşik miktarlarda en son teknolojiürünü birincil tarama yapabilmek doğal ürün araştırmalarında son derece önemlidir. Antibakteriyel profilleme için IMC kullanımı ile, gerekli bileşik miktarı önemli ölçüde standart yöntemlere göre azalır. Bu teknik aynı zamanda yeni ilaçların mikrobiyal topluluk7ile etkileşimi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlar.
IMC, biyolojik sistemdeki tüm biyolojik, fiziksel ve biyokimyasal süreçler ve reaksiyonlar sonucunda toplam enerjiyi ölçmek için kurulmuş bir yöntemdir. Bakteriyel enerji salınımı toplam metabolik reaksiyonlar ile orantılıdır8. Kullanılan mikrocalorimetre gibi kapalı bir sistem içinde, ısı düzeyleri bakterilerin metabolik kinetik incelemek için mikrowatt aralığında ölçülebilir9,10,11,12. Bakteriler tarafından salınan ısı (enerji) metabolizmalarının altında yatan ve hücresel biyokütle ile orantılı olmayan hücresel fonksiyonlarla bağlantılıdır.
Başlangıçta, mikrobiyolojik tahliller için isothermal kalorimetre uygulanabilirliği düşük iş hacmi ve yüksek test hacimleri nedeniyle sınırlı olmuştur. Ancak, kullanılan mikrocalorimetre artan iş gücü ve daha düşük bileşik gereksinimleri ile izomal kalorimetre avantajlarını birleştirir gibi benzersizdir, hangi ilaç keşif uygulamaları için değerli bir araç yapar10. Ayrıca, cihaz 600 nm optik yoğunluğuölçümü dayalı standart bulanıklık yöntemi gibi bakteri büyüme kinetik ölçmek için alternatif yöntemler üzerinde daha fazla avantaj sağlar (OD<600). OD600’ün ölçülmesi, artan optik yoğunluğun mikrobiyal büyümeye eşit olduğu varsayımına dayanır ve böylece canlı olmayan hücrelerin varlığını ihmal eder. Bu yöntem, küçük koloni varyantlarını ve persister hücreleri hariç olduğu için de eleştirilmiştir11. Buna karşılık, IMC canlı hücrelerin her türlü gerçek zamanlı gözlem sağlar. Hücreler hareketsiz ise, hala metabolik aktivite sergilerler ve böylece IMC tarafından tespit edilebilirler, oysa bu tür fenomenler standart bulanıklık yöntemi11ile saptanamaz. IMC’nin diğer avantajları arasında daha kısa bir antimikrobiyal duyarlılık test süresi, karmaşık bir topluluktaki ilaç etkileşimlerinin ölçülmesi ve standart analiz yöntemleri nin örnek7’yiyok etmeden yer alması yer almaktadır.
IMC teknolojisi mikrobiyolojitermogenez ve kanser biyolojisi13,14,,15,16,17arasında değişen çalışmalar geniş bir yelpazede uygulanmıştır.17 Mikrobiyal uygulamalar çeşitli bakteriyel suşlara karşı bileşiklerin minimum inhibitör konsantrasyonları (MIC) belirlenmesi içerir. Çeşitli çalışmalar yapılmıştır ve bakteri türlerinin çoğunluğu için izopekmal kalorimetre MIC veri daha hızlı elde edilebilir ve sonuçlar MIC tayini için diğer (standart) yöntemlere göre benzer olduğu sonucuna varılmıştır12,18,19. IMC’nin diğer uygulamaları arasında ilaçların etkileşiminin ve ilaç tedavilerinin biyofilm11gibi karmaşık bakteri topluluklarıyla birleştirilmesinin gözlemleni yer almaktadır. MoA profilleme odaklanan bir çalışma da mikrocalorimetre birinci ve ikinci nesil sefalosporinler bir fark tespit edebilirsiniz gösterdi, aynı MoA ile farklı antibiyotikler birbirlerine göre benzer bir ısı akış eğrisi sergilerken18.
Burada, yeni izomal mikrocalorimetri aleti kullanarak yeni doğal ürünlerin MoA profilleme için IMC kullanımını açıklar. Bu yöntem etkili antibiyotik konsantrasyonlarını belirlemek ve bakterilerin veya bakteriyostatik mekanizmalar açısından antibiyotiklerin özelliklerini tanımlamak için kullanılır. Yöntem moa bileşikprofilleme de yaygın olarak uygulanabilir ve standart mikrobiyolojik yöntemlerin yerini alabilir veya en azından tamamlayıcı olabilir. Gelecekteki çalışmalar, hedef mekanizmalara dayalı antibiyotik sınıflarının farklılaşmasını sağlayacak derinlemesine parmak izi analizlerini içerecektir.
İzotermal mikrokalorimtri bir numuneden yayılan enerjiyi zaman içinde ölçer ve bu enerji salınımı tüm biyolojik, fiziksel ve (biyo-) kimyasal süreçlerin bir sonucudur. Ölçülen ısı akışı, metabolik aktivitenin sürekli gerçek zamanlı izlenmesini sağladığından maddelerin antibakteriyel etkilerini değerlendirmek veya belirlemek için kullanılabilir.
Analiz için güvenilir veri elde etmek için, doğru başlangıç koloni oluşturma birimleri (CFU) kullanılan her tür veya gerginlik için ayrı ayrı belirlenmelidir. CFU sayısının çok düşük olması durumunda, sistemin tespit edilmesi için yeterli ısı üreten kritik miktarda biyokütleye ulaşması daha uzun sürdüğünden, bu durum uzun bir gecikme fazına yol açar. CFU sayısının çok yüksek olması durumunda gecikme fazı çok kısa olacaktır ve üretilen ısı miktarı komşu sensör hücrelerine (referans ve deneysel kuyular) ısı transferine ve termogramların bozulmasına neden olabilir. CFU yüksek sayıda da daha hızlı bir oksijen tükenmesi yol açacaktır ve anaerobik koşullara geçmek. Ayrıca, denemenin ilk 30 dakikası boyunca, sistem dengelendiğinde, veri toplamanın mümkün olmadığı ve efektlerin gerçek kaydının geciktiği de göz önünde bulundurulmalıdır. Buna ek olarak, yanlış CFU tayini yanlış MIC tayini yol açar, sonuçta deney etkileyen ve değişiklikler25gözlenen . Bir diğer kritik nokta da taban çizgisinin doğru belirlenmesidir. Genellikle, ısı akışı sinyali sıfır olduğunda ve ideal olarak, taban çizgisi tanımı için zaman aralığı >30 dk olduğunda, gecikme aşamasında temel sinyal seçilir. Ancak, bakterilerin ısı sinyali algılama sınırına ulaşmak için ihtiyaç duyduğu süre suşlar ve türler arasında farklılık gösterirken, bu her zaman mümkün değildir. Diğer türler veya türler ilk 30 dakika içinde ulaşırken bazı türler veya suşlar ısı sinyali algılama sınırına ulaşmak için 30 dakikadan fazla zaman alar. Bu durumda, tüm ısı sinyalleri sıfıra düştüğünde ve sabit kaldığında deney sonundaki temel sinyali seçmek mümkündür. Alternatif olarak, aynı bakteriyel suşu ile diğer deneylerden taban çizgileri kullanılabilir, ancak tavsiye edilmez.
Sistem, denemelerin ve sorun gidermelerin tasarım ve optimizasyonu açısından bazı esneklikler sağlar. Kullanılan hacimler, plastik kesici uçlar ve 100-600 μL plastik kesici uçlar olmadan titanyum kaplar kullanılırken 100-300 μL aralığındadır. Üretici tarafından önerilen çalışma hacmi 120 μL’dir. Yeni bir deneysel seri kurarken farklı hacimlerin kullanılması ve ölçümler için en uygun koşulların bulunması, esas olarak iki parametre üzerinde bir etkiye sahiptir. Daha düşük hacimler kullanılarak, gerekli test bileşiği miktarı azaltılabilir, bu da özellikle küçük miktarlarda bulunan bileşikler için önemlidir. Buna ek olarak, kullanılan hacim, ölçüm sırasında oksijen kullanılabilirliğini doğrudan etkiler ve daha düşük hacimlerde bakteri büyümesi için gerekli olan mevcut oksijen miktarını artırır. Oksijen tükenmesi, deneyin mümkün olan en uzun süreye katkıda bulunan ana faktörlerden biridir. Daha da önemlisi, sadece sıvı ortam değil, katı ortam da kullanmak mümkündür. Katı ve gaz fazı arasındaki arayüz üzerinde büyüme daha iyi oksijen erişimi sağlar gibi bu özellikle yavaş büyüyen mikroorganizmalar için önemlidir9.
IMC fizik, kimya ve biyoloji uygulamaları ile bilinmeyen süreçleri keşfetmek için yararlı bir analitik araçtır. Yöntem kapalı bir sistem içinde ısı alışverişini ölçer ve kaydedilen ısı değişiminin analizi her zaman standart yöntemlerle elde edilemeyen ek bilgiler sağlar. Mikrobiyoloji ve antibiyotik araştırmalarında, IMC’nin en büyük avantajlarından biri canlı, ölü ve persister veya uykuda hücreler arasında ayrım yeteneğidir, hangi standart bulanıklık yöntemleri kullanılarak mümkün değildir11. Buna ek olarak, IMC son derece hassastır ve 10-105 hücre9gibi az ısı emisyonu algılayabilir. Başka bir avantajı deneysel kurulum hızlı ve kolay olmasıdır, ve hiçbir kullanıcı müdahalesi en az ile sürekli, gerçek zamanlı izleme için izin verir. Ayrıca, IMC örneklerin daha fazla analiz edilmesini sağlayan tahribatsızdır. Veri analizi geç üstel veya erken sabit faz ve sabit fazda metabolik aktivite kadar biyokütle oluşumunun ayrıştırma sağlar.
Yukarıda bahsedilen roman ve heyecan verici uygulama özelliklerinin yanı sıra, bu yöntemin sakıncaları da vardır. En büyük sınırlama, IMC cihazlarının belirli bir sistem içinde üretilen ve serbest bırakılan ve spesifik olmayan sinyalleri de içeren toplam ısıyı ölçmesidir. Bu, ısı akışı9,20kayıt ile ölçülen ısı sinyali değişiklikleri değerlendirmek edebilmek için uygun kontroller ile deneysel planlama önemini vurgulamaktadır.
Elimizde, IMC yeni doğal ürünlerin antibakteriyel etkilerini incelemek ve etkili konsantrasyon aralıklarını belirlemek için önemli bir araçtır. Bakteriyostatik ve bakterisidal etkilerin farklıolması nın yanı sıra, gelecekte hedef tanımlama çalışmaları ve MoA tayini nin bir parçası olarak kullanılabilir. Bu burada görüntülenen yeni aktif bileşiklerin termogramlar farklı antibiyotik sınıfların termogramlar karşılaştırarak yapılabilir. Ancak, ölçülen verilerden çıkarılabilen bazı ölçülebilir parametrelerin bu tür karşılaştırmalar için yeterli olup olmadığı veya tam termogramlara dayalı parmak izi veren algoritmalar üzerinde çalışmak gerekip gerekmediği hala araştırılmalıdır. Antibiyotik araştırma alanında başka bir olası uygulama dirençli klonlar wildtype karşılaştırılması, tüm genom dizilimi ile birleştiğinde, hangi yeni antibakteriyellerin modu-direnç (MoR) açıklığa kavuşturulması yardımcı olabilir. Yöntemin statik doğası nedeniyle, biyofilm oluşumu nda veya halihazırda kurulmuş biyofilmlerde yeni ajanların etkinliğinin araştırılması biyolojik sürecin daha iyi anlaşılmasına ve seçilen ajanların uykunun farklı aşamalarında mikroplar üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. IMC, ısı şeklinde açığa çıkan toplam enerjiyi kaydeder ve transkripsiyonla birleşen aktif maddelerin alt inhibitör etkilerini araştırmak için uygun bir yöntem dir. Bu yöntem aynı zamanda klinik ortamlarda numunelerin kontaminasyonunu tespit etmek veya hastaların kesin tedavisine hızla karar vermeye yardımcı olan antibiyogramların belirlenmesi nde de kullanılabilir11.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar verimli tartışmalar için Symcel ekibi teşekkür etmek istiyorum ve biz Ganna Oliynyk ve Wilhelm Paulander büyük destek kabul etmek istiyorum. Biz de usta teknik destek için doğal ürün ve Stefanie Schmidt sağlamak için Daniel Kohnhäuser teşekkür etmek istiyorum.
Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
calView software | Symcel | collection and analysis software | |
calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
Tweezers | Symcel | 1900602 |