Ylerifieringen av ett nytt antibiotikums verkningssätt är en utmanande uppgift i läkemedelsupptäcktsprocessen. Målet med metoden som beskrivs här är tillämpningen av isotermiska mikrokalorimetry med hjälp av calScreener i antibakteriella profilering för att ge ytterligare insikt i läkemedels-mikrob interaktioner.
På grund av det globala hotet om ökande antimikrobiell resistens behövs det ett akut behov av nya antibiotika. Vi undersöker naturliga produkter från Myxobakterier som en innovativ källa till sådana nya föreningar. En flaskhals i processen är vanligtvis klarläggande av deras verkningssätt. Vi etablerade nyligen isotermiska mikrokalorimetry som en del av en rutinmässig profilering pipeline. Denna teknik möjliggör för undersökning av effekten av antibiotikaexponering på den totala bakteriell metaboliska responsen, inklusive processer som är frikopplade från biomassabildning. Viktigt, bakteriostatiska och bakteriedödande effekter är lätt urskiljbara utan någon användare ingripande under mätningarna. Isotermisk mikrokalorimetry är dock ett ganska nytt tillvägagångssätt och att tillämpa denna metod på olika bakteriearter kräver vanligtvis förvärdering av lämpliga mätförhållanden. Det finns några referens termogram tillgängliga av vissa bakterier, kraftigt underlätta tolkning av resultat. Eftersom poolen av referensdata stadigt växer förväntar vi oss att metoden kommer att få allt större effekt i framtiden och förväntar oss att den möjliggör djupgående fingeravtrycksanalyser som möjliggör en differentiering av antibiotikaklasser.
Syftet med denna metod är att tillämpa isotermisk mikrokalorimetry (IMC) som en medelhög genomströmningsanalys i mode-of-action (MoA) profilering av nya antibakteriella föreningar. Denna metod avslöjar data angående aktiviteten hos föreningar på bakteriearter och ger information om den bakteriedödande eller bakteriostatiska karaktären hos själva föreningen.
Ökningen av framväxande antimikrobiell resistens (ANTIR) är ett globalt problem och det leder till mindre effektiva behandlingar av vanliga infektioner med kända antibiotika1. Men sökandet efter nya föreningar och läkemedel som kan ersätta eller arbeta i kombination med kända antibiotika pågår och detta bygger på olika metoder. Naturliga produkter är en viktig aktör i nuvarande kampanjer drog upptäckt och särskilt i anti-infective drug discovery2. Att identifiera nya blystrukturer för antibiotikautveckling är dock en lång och finansiellt krävande process3. Således är de tidiga upptäcktsstegen oerhört viktiga för att kunna filtrera på de flesta lovande byggnadsställningar redan i ett tidigt skede. Inledande steg i naturliga produkt läkemedel upptäckt inkluderar att få en förening struktur, bestämma aktiviteten in vitro tillsammans med MoA och mål identifiering. Mest framgångsrika föreningar är berättigade till ytterligare utveckling bör visa ett gynnsamt spektrum av verksamhet (dvs. bredspektrum aktivitet i fråga om antibakteriella medel) och en ny MoA genom vilken redan existerande AMR kan övervinnas. Lovande byggnadsställningar sedan typiskt screenas i sekundära analyser, som inkluderar in vivo biotillgänglighet, toxicitet, och metabolism4. Förutom de ekonomiska oro, naturliga produkt läkemedel upptäckt står inför ytterligare utmaningar rörande kostnader och tekniska svårigheter i samband med sammansatt isolering och rening, som i sin tur kan göra det svårt att få flera milligram eller ens gram belopp i ett tidigt skede av upptäckten processen5,6. Därför är det av yttersta vikt inom naturproduktforskningen att kunna utföra toppmodern primärscreening med minimala sammansatta mängder för att kunna fatta ett välgrundat beslut om ytterligare investeringar för att göra en ny naturlig produkt tillgänglig för preklinisk utveckling. Med användning av IMC för antibakteriell profilering, mängden av föreningen som behövs minskas avsevärt i jämförelse med standardmetoder. Tekniken ger också mer ingående information om samspelet mellan nya läkemedel med det mikrobiella samhället7.
IMC är en väletablerad metod för att mäta total energi som ett resultat av alla biologiska, fysikaliska och biokemiska processer och reaktioner i ett biologiskt system. Bakteriell energi release är proportionell mot den totala metaboliska reaktioner8. Inom ett slutet system, såsom den använda mikrokalorimetern, kan värmenivåerna mätas i mikrowattområdet för att studera den metaboliska kinetiken hos bakterier9,10,11,12. Den värme (energi) som frigörs av bakterier är kopplad till cellulära funktioner som ligger bakom deras ämnesomsättning och som inte nödvändigtvis är proportionell mot cellulära biomassa.
Inledningsvis har tillämpligheten av isotermisk kalorimetri för mikrobiologiska analyser varit begränsad på grund av dess låga genomströmning och höga testvolymer. Den använda mikrokalorimetern är dock unik eftersom den kombinerar fördelarna med isotermisk kalorimetri med ökad genomströmning och lägre sammansatta krav, vilket gör den till ett värdefullt verktyg förläkemedelsupptäcktsapplikationer 10. Vidare ger instrumentet ytterligare fördelar jämfört med alternativa metoder för mätning av bakterietillväxtkinetik, såsom standardturbiditetsmetoden, som bygger på mätning av optisk densitet vid 600 nm (OD<600). Mätning OD600 bygger på antagandet att ökad optisk densitet är lika med mikrobiell tillväxt, och därigenom försumma förekomsten av icke-livskraftiga celler. Denna metod har också kritiserats eftersom det utesluter små kolonivarianter och persisterceller11. I motsats till detta tillåter IMC realtidsobservation av någon typ av livskraftiga celler. Om celler är vilande uppvisar de fortfarande metabolisk aktivitet och de kan därmed upptäckas av IMC, medan sådana fenomen inte kan upptäckas med hjälp av standard grumlighetsmetod11. Andra fördelar med IMC inkluderar en kortare antimikrobiell resistenstesttid, mätning av läkemedelsinteraktioner i ett komplext samhälle och standardanalysmetoder utan att förstöra provet7.
IMC-tekniken har implementats i ett brett spektrum av studier, allt från mikrobiologi till termogenes och cancerbiologi13,14,15,16,17. De mikrobiella tillämpningarna omfattar bestämning av minsta hämmande koncentrationer (MIC) av föreningar mot olika bakteriestammar. Flera studier har gjorts och man har kommit fram till att MIC-data från isotermisk kalorimetri för majoriteten av bakteriearter kan fås snabbare och resultat är liknande jämfört med andra (standard) metoder för MIC-bestämning12,18,19. Ytterligare tillämpningar av IMC inkluderar observera interaktion av läkemedel och kombination av läkemedelsbehandlingar med komplexa bakteriella samhällen såsom biofilmer11. En studie med fokus på MoA profilering visade att mikrokalorimetern kan upptäcka en skillnad i första och andra generationens cefalosporiner, medan olika antibiotika med samma MoA uppvisar en liknande värmeflödeskurva jämfört med varandra18.
Här beskriver vi användningen av IMC för MoA-profilering av nya naturliga produkter med hjälp av det nya isotermiska mikrokalorimetriinstrumentet. Metoden används för att bestämma effektiva antibiotikakoncentrationer och för att beskriva egenskaper hos antibiotika vad gäller bakteriedödande eller bakteriostatiska mekanismer. Metoden kan i stort sett genomföras i MoA-profilering av föreningar och den kan ersätta eller åtminstone komplettera standardmikrobbiologiska metoder. Framtida studier kommer att omfatta djupgående fingeravtrycksanalyser som möjliggör differentiering av antibiotikaklasser baserat på målmekanismer.
Isotermiska mikrokalorimetry mäter energi som släpps ut från ett exemplar över tiden och denna energi release är ett resultat av alla biologiska, fysiska och (bio-)kemiska processer. Det uppmätta värmeflödet kan utnyttjas för att utvärdera eller bestämma antibakteriella effekter av ämnen eftersom det möjliggör kontinuerlig realtidsövervakning av metabolisk aktivitet.
För att erhålla tillförlitliga uppgifter för analys behöver korrekta startkolonibildande enheter (CFU) fastställas individuellt för varje art eller stam som används. I fall CFU räkna är för låg, Detta leder till en långvarig lagfas som det tar längre tid för systemet att nå en kritisk mängd biomassa producerar tillräckligt med värme för att upptäckas. I fall CFU räkna är för hög lagfasen kommer att vara mycket kort, och mängden värme som produceras kan orsaka värmeöverföring till angränsande sensorceller (referens och experimentella brunnar) och orsaka snedvridningar av termogram. Höga antal CFU kommer också att leda till en snabbare syreutarmning och byta till anaeroba förhållanden. Man måste också ta hänsyn till att under de första 30 minuterna av försöket, när systemet är jämvikt, är insamling av uppgifter inte möjlig och den faktiska registreringen av effekter försenas. Dessutom leder felaktig CFU-bestämning till falsk MIC-bestämning, vilket i slutändan påverkar försöket och de förändringar som observerats25. En annan kritisk punkt är den korrekta bestämningen av baslinjen. Vanligtvis väljs baslinjesignalen under lagfasen när värmeflödessignalen är noll och helst är tidsintervallet för baslinjedefinitionen >30 min. Detta är dock inte alltid möjligt eftersom den tid som bakterierna kräver för att nå värmesignaldetektionsgränsen skiljer sig mellan stammar och arter. Vissa arter eller stammar kräver mer än 30 minuter för att nå värmesignaldetektionsgränsen medan andra stammar eller arter når den inom de första 30 minuterna. I så fall är det möjligt att välja baslinjesignalen i slutet av experimentet när alla värmesignaler har sjunkit tillbaka till noll och förblir stabil. Alternativt kan baslinjer från andra experiment med samma bakteriestam användas, vilket dock inte rekommenderas.
Systemet möjliggör viss flexibilitet vad gäller konstruktion och optimering av experiment och felsökning. Volymer som används ligger i intervallet 100-300 μL vid användning av plastinlägg och 100-600 μL vid användning av titankoppar utan plastinläggen. Tillverkarens rekommenderade arbetsvolym är 120 μL. Användningen av olika volymer vid inrättandet av en ny experimentell serie, och samtidigt som man hittar optimala förhållanden för mätningar, har en inverkan främst på två parametrar. Genom att använda lägre volymer kan mängden erforderligt test sammansatt minskas, vilket är särskilt viktigt för föreningar, som endast finns i små mängder. Dessutom påverkar den använda volymen direkt syretillgängligheten under mätningen med lägre volymer som ökar mängden tillgängligt syre som krävs för bakterietillväxt. Syreutarmning är en av de viktigaste faktorerna som bidrar till den maximala möjliga varaktigheten av experimentet. Viktigt är det möjligt att använda fasta medier, inte bara flytande media. Detta är särskilt viktigt för långsamt växande mikroorganismer som tillväxt på gränssnittet mellan fasta och gas fas möjliggör bättre syre tillgång9.
IMC är ett användbart analytiskt verktyg för att upptäcka okända processer med tillämpningar inom fysik, kemi och biologi. Metoden mäter värmeväxlingen inom ett slutet system och analys av det registrerade värmeutbytet ger ytterligare information som inte alltid kan erhållas med standardmetoder. Inom mikrobiologi och antibiotika forskning, en av de största fördelarna med IMC är dess förmåga att skilja mellan levande, döda och persister eller vilande celler, vilket inte är möjligt med hjälp av standard grumlighet metoder11. Dessutom är IMC mycket känslig och det kan upptäcka värmeutsläpp från så få som 104-105 celler9. En annan fördel är att den experimentella setup är snabb och enkel, och det möjliggör kontinuerlig, realtid spårning med minimal till ingen användarstörning. Vidare är IMC icke-förstörande, vilket möjliggör ytterligare analys av prover. Dataanalys möjliggör frikoppling av biomassabildning tills sen exponentiell eller tidig stationär fas och metabolisk aktivitet i stationär fas.
Förutom romanen och spännande programfunktioner som nämns ovan, finns det också nackdelar med denna metod. Den stora begränsningen är att IMC-instrument mäter den totala värme som produceras och frigörs inom ett specifikt system, som även omfattar icke-specifika signaler. Detta belyser vikten av experimentell planering med lämpliga kontroller för att kunna bedöma de värmesignalförändringar som mäts genom registrering avvärmeflöde 9,20.
I våra händer är IMC ett viktigt verktyg för att studera antibakteriella effekter av nya naturliga produkter och för att bestämma effektiva koncentrationsintervall. Bortsett från att skilja bakteriostatiska och bakteriedödande effekter, det skulle kunna användas i framtiden som en del av mål identifiering studier och MoA bestämning. Detta kan göras genom att jämföra termogram av olika antibiotiska klasser till termogram av nya aktiva föreningar som visas här. Det måste dock fortfarande undersökas om vissa kvantifierbara parametrar som kan extraheras från de uppmätta uppgifterna är tillräckliga för sådana jämförelser eller om det kommer att bli nödvändigt att arbeta med algoritmer som ger fingeravtryck baserade på fullständiga termogram. En annan möjlig tillämpning inom antibiotikaforskning är jämförelsen av vildtyp mot resistenta kloner, tillsammans med hela genomsekvensering, vilket kan bidra till att belysa mode-of-resistance (MoR) av nya antibakteriella medel. På grund av metodens statiska karaktär skulle utredning av effekten av nya agenser på antingen biofilmsbildning eller på redan etablerade biofilmer kunna leda till bättre förståelse av den biologiska processen och effekten av utvalda agenser på mikrober i olika stadier av dvala. IMC registrerar total energi som frigörs i form av värme vilket gör det till en lämplig metod för att undersöka även subhämmande effekter av aktiva substanser som kan kopplas till transkriptomik. Denna metod kan också användas i kliniska inställningar för att upptäcka kontaminering av prover eller för bestämning av antibiogram som hjälper till att snabbt besluta om bestämd behandling av patienterna11.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka teamet av Symcel för givande diskussioner och vi vill erkänna det stora stödet från Ganna Oliynyk och Wilhelm Paulander. Vi vill också tacka Daniel Kohnhäuser för att ha tillhandahållit den naturliga produkten och Stefanie Schmidt för skicklig teknisk support.
Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
calView software | Symcel | collection and analysis software | |
calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
Tweezers | Symcel | 1900602 |