Misurazione di distribuzioni cAMP tridimensionali in cellule viventi utilizzando imaging e analisi FRET iperspettrale a 4 dimensioni (x, y, z e λ)
Summary
A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.
Abstract
L’AMP ciclico è un secondo messaggero che è coinvolto in una vasta gamma di attività cellulari e fisiologiche. Diversi studi suggeriscono che i segnali cAMP sono compartimentati e che la compartimentazione contribuisce alla specificità della segnalazione all’interno della via di segnalazione cAMP. Lo sviluppo di biosensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET) ha favorito la capacità di misurare e visualizzare i segnali cAMP nelle cellule. Tuttavia, queste misurazioni sono spesso limitate a due dimensioni spaziali, il che può comportare un’interpretazione errata dei dati. Ad oggi, ci sono state solo misurazioni molto limitate dei segnali cAMP in tre dimensioni spaziali (x, y e z), a causa delle limitazioni tecniche nell’utilizzo dei sensori FRET che mostrano intrinsecamente un basso rapporto segnale/rumore (SNR). Inoltre, i tradizionali approcci di imaging basati su filtri sono spesso inefficaci per la misurazione accurata dei segnali cAMP nelle regioni subcellulari localizzate a causa di una serie di fattori, tra cui la diafonia spettrale, la potenza limitata del segnale e l’autofluorescenza. Per superare queste limitazioni e consentire l’utilizzo di biosensori basati su FRET con più fluorofori, abbiamo sviluppato approcci di imaging e analisi FRET iperspettrali che forniscono specificità spettrale per il calcolo delle efficienze FRET e la capacità di separare spettralmente i segnali FRET dall’autofluorescenza confondente e / o segnali da etichette fluorescenti aggiuntive. Qui, presentiamo la metodologia per l’implementazione dell’imaging FRET iperspettrale e la necessità di costruire una libreria spettrale appropriata che non sia né sottocampionata né sovracampionata per eseguire l’unmixing spettrale. Mentre presentiamo questa metodologia per la misurazione delle distribuzioni tridimensionali di cAMP nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC), questa metodologia potrebbe essere utilizzata per studiare le distribuzioni spaziali di cAMP in una gamma di tipi di cellule.
Introduction
L’adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è un secondo messaggero coinvolto nei principali processi cellulari e fisiologici tra cui la divisione cellulare, l’afflusso di calcio, la trascrizione genica e la trasduzione del segnale. Un numero crescente di prove suggerisce l’esistenza di compartimenti cAMP nella cellula attraverso i quali si raggiunge la specificità di segnalazione1,2,3,4,5,6,7. Fino a poco tempo fa, la compartimentazione cAMP era dedotta sulla base di distinti effetti fisiologici o cellulari indotti da diversi agonisti del recettore accoppiato G8,9,10,11. Più recentemente, le sonde di imaging a fluorescenza basate su FRET hanno fornito nuovi approcci per la misurazione diretta e l’osservazione dei segnali cAMP in una cella12,13,14.
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un fenomeno fisico in cui il trasferimento di energia avviene tra molecole donatrici e accettori in modo non radiativo quando le molecole sono in prossimità15,16. Con lo sviluppo di indicatori fluorescenti basati su FRET, questo fenomeno fisico è stato utilizzato in applicazioni biologiche per studiare le interazioni proteina-proteina17, co-localizzazione proteica18, Ca+2 segnalazione19, espressionegenica 20, divisione cellulare21 e segnalazione nucleotidica ciclica. Gli indicatori cAMP basati su FRET sono tipicamente costituiti da un dominio di legame cAMP, un fluoroforo donatore e un fluoroforo accettore22. Ad esempio, il sensore H188 cAMP12,22 utilizzato in questa metodologia è costituito da un dominio di legame cAMP ottenuto da Epac, inserito tra fluorofori Turchese (donatore) e Venere (accettore). In condizioni basali (non legate), Turchese e Venere sono in un orientamento tale che FRET si verifica tra i fluorofori. Al momento del legame di cAMP al dominio di legame, si verifica un cambiamento conformazionale tale che Turchese e Venere si allontanano con conseguente diminuzione di FRET.
Gli approcci di imaging basati su FRET offrono uno strumento promettente per indagare e visualizzare i segnali cAMP all’interno di una cellula. Tuttavia, le attuali tecniche di imaging microscopico basate su FRET hanno spesso solo parzialmente successo nel raggiungere una potenza del segnale sufficiente per misurare FRET con chiarezza spaziale subcellulare. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la limitata potenza del segnale di molti reporter FRET, l’alto livello di precisione richiesto per quantificare con precisione i cambiamenti nell’efficienza FRET e la presenza di fattori confondenti, come l’autofluorescenza cellulare23,24. Il risultato è spesso un’immagine FRET che è afflitta da SNR debole, rendendo molto difficile la visualizzazione dei cambiamenti subcellulari in FRET. Inoltre, lo studio dei segnali cAMP localizzati spazialmente è stato eseguito quasi esclusivamente in due sole dimensioni spaziali e la distribuzione assiale cAMP è stata raramenteconsiderata 25. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che un basso SNR ha impedito la capacità di misurare e visualizzare i gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali. Per superare i limiti dell’utilizzo di sensori FRET con basso SNR, abbiamo implementato approcci di imaging e analisi iperspettrali per misurare FRET in singole celle25,26,27.
Gli approcci di imaging iperspettrale sono stati sviluppati dalla NASA per differenziare gli oggetti terrestri presenti nelle immaginisatellitari28,29. Da allora queste tecniche sono state tradotte nel campo di microscopia a fluorescenza30, con diversi sistemi di microscopio confocale commerciali che offrono rivelatori spettrali. Nell’imaging a fluorescenza tradizionale (non spettrale), il campione viene eccitato utilizzando un filtro passa-banda o una linea laser e l’emissione viene raccolta utilizzando un secondo filtro passa-banda, spesso selezionato per corrispondere alla lunghezza d’onda di emissione di picco del fluoroforo (s). Al contrario, gli approcci di imaging iperspettrale cercano di campionare un profilo spettrale completo dell’emissione di fluorescenza26,31,32 o dell’eccitazione33,34 a specifici intervalli di lunghezza d’onda. Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che gli approcci di imaging e analisi iperspettrali possono offrire una migliore quantificazione dei segnali FRET nelle cellule rispetto alle tradizionali tecniche di imaging FRET basate su filtro26. Qui presentiamo una metodologia per l’esecuzione di imaging e analisi FRET iperspettrali 4-dimensionali (x, y, z e λ) per misurare e visualizzare le distribuzioni cAMP in tre dimensioni spaziali. Questi approcci hanno permesso la visualizzazione di gradienti spaziali cAMP indotti da agonisti in singole cellule25. È interessante notare che, a seconda dell’agonista, i gradienti cAMP possono essere evidenti nelle cellule. La metodologia qui presentata utilizza l’unmixing spettrale di fondo non uniforme e l’autofluorescenza cellulare per migliorare l’accuratezza delle misurazioni FRET. Mentre questa metodologia è dimostrata nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC) utilizzando un biosensore cAMP FRET, la metodologia potrebbe essere facilmente modificata per l’uso con reporter FRET alternativi o linee cellulari alternative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo di biosensori FRET ha permesso la misurazione e la visualizzazione di segnali nucleotidici ciclici in singole cellule, e c’è una grande promessa per la visualizzazione degli eventi di segnalazione subcellulare13,22,37,38. Tuttavia, l’uso di biosensori FRET presenta diverse limitazioni, tra cui le basse caratteristiche segnale-rumore di molti reporter FRET fluorescenti basati su pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute e van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Paesi Bassi) per averci fornito il biosensore H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) per l’aiuto tecnico nel ridurre il tempo impiegato per eseguire i nostri script di programmazione sviluppati su misura.
Gli autori desiderano riconoscere le fonti di finanziamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).
