نموذج الماوس استئصال العظام لسرطان البنكرياس
Summary
في السياق السريري، سيخضع المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس الموضعي لاستئصال البنكرياس يليه العلاج المساعد. يهدف هذا البروتوكول المبلغ عنه هنا إلى إنشاء طريقة آمنة وفعالة لنمذجة هذا السيناريو السريري في الفئران العارية ، من خلال زرع العظام لسرطان البنكرياس يليه استئصال البنكرياس واستئصال الطحال.
Abstract
هناك نقص في نماذج الحيوانات مرضية لدراسة العلاج المساعد و / أو neoadjuvant في المرضى الذين يجري النظر لعملية جراحية لسرطان البنكرياس (PC). لمعالجة هذا النقص، ونحن نصف نموذج الماوس التي تنطوي على زرع العظام من جهاز الكمبيوتر تليها استئصال البنكرياس البعيدة واستئصال الطحال. وقد ثبت أن النموذج آمن ومرن بشكل مناسب لدراسة مختلف النهج العلاجية في البيئات المساعد و المساعد الجديد.
في هذا النموذج, يتم إنشاء ورم البنكرياس لأول مرة عن طريق زرع خليط من خلايا سرطان البنكرياس البشري (لوسيفيراز الموسومة AsPC-1) وسرطان الإنسان المرتبطة خلايا البنكرياس ستيلاتي في البنكرياس البعيدة من الفئران العارية بالب / ج اللاهية. بعد ثلاثة أسابيع ، يتم استئصال السرطان عن طريق إعادة استئصال البطن ، واستئصال البنكرياس البعيدة واستئصال الطحال. في هذا النموذج، يمكن استخدام التصوير الإضاءة الحيوية لمتابعة التقدم المحرز في تطور السرطان وآثار استئصال / العلاجات. بعد استئصال, يمكن إعطاء العلاج المساعد. بدلا من ذلك، يمكن إعطاء العلاج النيواديفانت قبل استئصال.
يتم تقديم بيانات تمثيلية من 45 فأرا. خضعت جميع الفئران لاستئصال البنكرياس /استئصال الطحال بنجاح دون أي مشاكل في الهموستاسي. تم تحقيق هامش البنكرياس القريب الكلي أكبر من 5 مم في 43 (96٪) في 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 فئران. وكان معدل النجاح التقني لاستئصال البنكرياس 100٪، مع 0٪ من الوفيات المبكرة والمراضة. لم يمت أي من الحيوانات خلال الأسبوع التالي لاستئصالها.
باختصار، نحن نصف تقنية قوية وقابلة للاستنساخ لنموذج استئصال جراحي لسرطان البنكرياس في الفئران الذي يحاكي السيناريو السريري. قد يكون النموذج مفيدا لاختبار كل من العلاجات المساعد والعلاج المساعد الجديد.
Introduction
ويرتبط سرطان الغدة القنوات البنكرياسية (سرطان البنكرياس [PC]) مع سوء التكهن1. يبقى الاستئصال الجراحي العلاج العلاجي الوحيد المحتمل للكمبيوتر الشخصي وينبغي النظر فيه للمرضى الذين يعانون من مرض المرحلة المبكرة. لسوء الحظ ، حتى مع استئصال R0 (أي هوامش استئصال خالية من الورم) ، فإن معدل التكرار (المحلي أو من مرض النقيلي غير المكتشف) مرتفع2،3. لذلك ، يشار إلى العلاج المساعد الجهازي في جميع المرضى تقريبا الذين يخضعون لاستئصال4. وعلاوة على ذلك، في حين يوصى الآن العلاج neoadjuvant فقط للسرطانات الحدية resectable، مؤشراتها آخذة في التوسع بحيث استخدامه الروتيني هو محور الكثير من البحوث السريرية5،6،7،8. من أجل تطوير نهج علاجية جديدة للكمبيوتر تنطوي على استئصال، وهذه النهج تحتاج إلى تقييم لأول مرة في النماذج ما قبل السريرية التي تلخص بدقة البيئات السريرية.
وقد استخدمت نماذج الماوس Orthotopic من جهاز الكمبيوتر في كثير من الأحيان في الماضي لاختبار العلاجات الدوائية9،10. تم إنتاج العديد من هذه عن طريق حقن الخلايا السرطانية وحدها في البنكرياس الماوس، مما أدى إلى الأورام التي تفتقر إلى ستروما البارزة التي هي سمة من سمات جهاز الكمبيوتر. في الآونة الأخيرة، نماذج تقويم العظام المشاركة في الحقن، مثل تلك التي قمنا بتطويرها لأول مرة عن طريق حقن خليط من جهاز الكمبيوتر البشري والخلايا النجمية البنكرياس الإنسان (PSCs، المنتجين الرئيسيين للستروما الكولاجين في PC)، قد حان للاستخدام المنتظم11،12. الأورام التي تنتجها مثل هذه الحقن المشترك للسرطان والخلايا السترومية تظهر (1) كل من عناصر السرطان وعنصر سترومال مميزة (desmoplastic) من جهاز الكمبيوتر، و (2) تعزيز انتشار الخلايا السرطانية والانبثاث11. وهكذا، فإن هذا النموذج يشبه إلى حد كبير الكمبيوتر البشري. في حين تم وصف عدد من النماذج استئصالي من جهاز الكمبيوتر التقويمي13,14,15,16, لا شيء قد عكست الحقائق السريرية لاستئصال البنكرياس في البشر دقيقة مثل هذا النموذج, وبالتالي كانت دون المستوى الأمثل لاختبار العلاجات المساعد أو neoadjuvant.
وكانت أهداف نموذج الماوس المقدمة هي توضيح كيفية: (1) زرع سرطان البنكرياس التقويمي بنجاح مع تقليل الانتشار البريتوني غير المقصود و(2) في وقت لاحق استئصال السرطان تماما. تسلط الورقة الضوء على النصائح والمزالق المحتملة لهذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الماوس التقويمي استئصال سرطان البنكرياس مهم لأنه يسمح لاختبار العلاجات المساعد وneadjuvant. وهذا مهم بشكل خاص في سرطان البنكرياس حيث الجراحة لا تزال العلاج الأكثر فعالية ولكن يرتبط مع ارتفاع خطر تكرار. تصف هذه الورقة طريقة من شأنها أن تنتج بشكل موثوق سرطان البنكرياس الذي يحتمل أن يكون ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقى المؤلفون الدعم من مؤسسة أفنر لسرطان البنكرياس.
Materials
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018)
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology – Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019)
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. 암 연구학. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following “curative” resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019)
- Maithel, S. K., Allen, P. J., Jarnagin, W. R. . Blumgart’s Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). , 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
