Generering af dynamiske miljøforhold ved hjælp af en mikrofluidisk højoverførselsenhed
Summary
Vi præsenterer et mikrofluidisk system til undersøgelser af komplekse livsmaskiner, som består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. Den mikrofluidiske chip giver mulighed for analyse af de meget komplekse og dynamiske mikromiljøforhold in vivo.
Abstract
Efterligning in vivo miljøforhold er afgørende for in vitro undersøgelser af komplekse liv maskiner. Men de nuværende teknikker rettet mod levende celler og organer er enten meget dyre, som robotteknologi, eller mangler nanoliter volumen og millisekund tid nøjagtighed i flydende manipulation. Vi præsenterer herved design og fremstilling af et mikrofluidisk system, der består af 1.500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. For at demonstrere kapaciteten af den mikrofluidiske enhed opretholdes neurale stamcellesfærer (NSC) i det foreslåede system. Vi bemærkede, at når NSC-kuglen udsættes for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, er den runde kropsbygning godt vedligeholdt. Variation i inputrækkefølgen af 6 lægemidler forårsager morfologiske ændringer i NSC-sfæren og udtryksniveauets repræsentative markør for NSC-stængel (dvs. Hes5 og Dcx). Disse resultater tyder på, at dynamiske og komplekse miljøforhold har stor indvirkning på NSC differentiering og selvfornyelse, og den foreslåede mikrofluidiske enhed er en passende platform for høj gennemstrømning undersøgelser af den komplekse levetid maskiner.
Introduction
Høj gennemløbsteknikker er afgørende for biomedicinske og kliniske undersøgelser. Ved parallelt at gennemføre millioner af kemiske, genetiske eller levende celle- og organoidtests kan forskere hurtigt identificere gener, der modulerer en biomolekylær vej, og tilpasse sekventiel lægemiddelinput til ens specifikke behov. Robotteknologi1 og mikrofluidiske chips i kombination med et enhedskontrolprogram gør det muligt at automatisere komplekse eksperimentelle procedurer, der dækker celle-/vævsmanipulation, væskehåndtering, billeddannelse og databehandling/kontrol2,3. Derfor kan hundreder og tusinder af eksperimentelle forhold opretholdes på en enkelt chip i henhold til den ønskedeoverførselshastighed 4,5.
I denne protokol beskrev vi design- og fabrikationsproceduren for en mikrofluidisk enhed, der består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og blandingsmodulus på stedet. 2-niveaus cellekulturkammeret forhindrer unødvendig forskydning under medium udveksling, hvilket sikrer et uforstyrret kulturmiljø til langsigtet levende cellebilleddannelse. Undersøgelserne viser, at den foreslåede mikrofluidiske enhed er en egnet platform til undersøgelser af høj gennemstrømning af de komplekse livsmaskiner. Desuden giver de avancerede træk ved den mikrofluidiske chip mulighed for automatiseret rekonstituering af meget komplekse og dynamiske mikromiljøforhold in vivo, som de stadigt skiftende cytokiner og ligands sammensætninger6,7, hvis færdiggørelse tager måneder for konventionelle platforme som 96-brønds plade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskellige mikrofluidiske enheder er udviklet til at udføre multiplekserede og komplekse eksperimenter17,18,19,20. For eksempel kan mikrowells lavet af en række topologiske fordybninger fange individuelle celler uden brug af ekstern kraft, der viser fordelagtige tegn, herunder lille prøvestørrelse, parallelisering, lavere materialeomkostninger, hurtigere respons, høj følsomhed<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere anerkender den tekniske støtte fra Zhifeng Cheng af Chansn Instrument (Kina) LTD. Dette arbejde blev støttet af tilskud (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
