יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה
Summary
אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.
Abstract
חיקוי התנאים הסביבתיים vivo הוא חיוני למחקרים במבחנה על מכונות חיים מורכבות. עם זאת, טכניקות הנוכחי מיקוד תאים חיים ואיברים הם גם יקר מאוד, כמו רובוטיקה, או חסר נפח nanoliter ודיוק זמן אלפית שנייה במניפולציה נוזלית. אנו מציגים בזאת את העיצוב וההמצאה של מערכת מיקרופלואידית, המורכבת מ-1,500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. כדי להדגים את היכולות של המכשיר המיקרופלואידי, כדוריות תאי גזע עצביים (NSC) נשמרות במערכת המוצעת. ראינו שכאשר תחום המל”ל נחשף ל- CXCL ביום 1 ו- EGF ביום 2, הקונפורמציה העגולה מתוחזקת היטב. שונות בסדר הקלט של 6 תרופות גורמת לשינויים מורפולוגיים בתחום המל”ל ולסמן הייצוגי ברמת הביטוי עבור גזעים של המל”ל (כלומר, Hes5 ו- Dcx). תוצאות אלו מצביעות על כך שלתנאים סביבתיים דינמיים ומורכבים יש השפעות רבות על הבידול וההתחדשות העצמית של המל”ל, והמכשיר המיקרופלואידי המוצע הוא פלטפורמה מתאימה למחקרי תפוקה גבוהים על מכונות החיים המורכבות.
Introduction
טכניקות תפוקה גבוהה חיוניות למחקרים ביו-רפואיים וקליניים. על ידי ביצוע מקביל של מיליוני בדיקות כימיות, גנטיות או חיות של תאים ואורגנואידים, החוקרים יכולים לזהות במהירות גנים המווסתים מסלול ביו-מולקולרי, ולהתאים אישית קלט תרופתי רציף לצרכים הספציפיים של האדם. רובוטיקה1 ושבבים מיקרופלואידיים בשילוב עם תוכנית בקרת מכשיר מאפשרים הליכים ניסיוניים מורכבים להיות אוטומטיים, כיסוי מניפולציה תא / רקמות, טיפול נוזלי, הדמיה, ועיבוד נתונים /שליטה 2,3. לכן, מאות ואלפי תנאים ניסיוניים יכולים להישמר על שבב אחד, על פי התפוקה הרצויה4,5.
בפרוטוקול זה תיארנו את הליך התכנון וההמצאה של מכשיר מיקרופלואידי, המורכב מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטלטיות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. תא תרבית התאים הדו-מפלס מונע גזירה מיותרת במהלך חילופי דברים בינוניים, המבטיחה סביבת תרבות ללא הפרעה להדמיית תאים חיים לטווח ארוך. המחקרים מראים כי המכשיר המיקרופלואידי המוצע הוא פלטפורמה מתאימה למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות החיים המורכבות. יתר על כן, התכונות המתקדמות של השבב המיקרופלואידי מאפשרות שחזור אוטומטי של תנאי מיקרו-וירוס מורכבים ודינמיים מאוד ב- vivo, כמו ציטוקינים משתנים והרכבי רצועות6,7, שהשלמתם לוקחת חודשים לפלטפורמות קונבנציונליות כמו צלחת 96 באר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשירים מיקרופלואידיים שונים פותחו לביצוע ניסויים מולטיפלקסים ומורכבים17,18,19,20. לדוגמה, microwells עשוי מערך של גושים טופולוגיים יכול ללכוד תאים בודדים ללא שימוש בכוח חיצוני, מראה תווים יתרון כולל גודל מדגם קטן, parallelization, על?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בתמיכה הטכנית של ג’יפנג צ’אנג מצ’אנסן אינסטרומנט (סין) בע”מ. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
