Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività
Summary
Presentiamo un sistema microfluidico per studi ad alta produttività su macchinari di vita complessi, composto da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Il chip microfluidico consente l’analisi delle condizioni micro-ambientali altamente complesse e dinamiche in vivo.
Abstract
Imitare le condizioni ambientali in vivo è fondamentale per gli studi in vitro su macchinari per la vita complessi. Tuttavia, le tecniche attuali che prendono di mira cellule e organi vivi sono molto costose, come la robotica, o mancano di volume nanolitro e precisione del tempo millisecondo nella manipolazione dei liquidi. Nel presente documento presentiamo la progettazione e la fabbricazione di un sistema microfluidico, composto da 1.500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Per dimostrare le capacità del dispositivo microfluidico, le sfere di cellule staminali neurali (NSC) vengono mantenute nel sistema proposto. Abbiamo osservato che quando la sfera NSC è esposta al CXCL nel primo giorno e all’EGF nel secondo giorno, la conformazione a forma rotonda è ben mantenuta. La variazione nell’ordine di input di 6 farmaci causa cambiamenti morfologici alla sfera NSC e al marcatore rappresentativo del livello di espressione per la stelo NSC (cioè Hes5 e Dcx). Questi risultati indicano che le condizioni ambientali dinamiche e complesse hanno grandi effetti sulla differenziazione e sull’autorinove NSC, e il dispositivo microfluidico proposto è una piattaforma adatta per studi ad alta produttività sui macchinari di vita complessi.
Introduction
Le tecniche ad alta produttività sono fondamentali per gli studi biomedici e clinici. Conducendo parallelamente milioni di test chimici, genetici o a cellule vive e organoidi, i ricercatori possono identificare rapidamente i geni che modulano una via bio-molecolare e personalizzare l’input sequenziale del farmaco in base alle proprio esigenze specifiche. I chiprobotici 1 e microfluidici in combinazione con un programma di controllo del dispositivo consentono di automatizzate procedure sperimentali complesse, che coprono la manipolazione di cellule / tessuti, la manipolazione di liquidi, l’imaging e l’elaborazione / controllodei dati 2,3. Pertanto, centinaia e migliaia di condizioni sperimentali possono essere mantenute su un singolo chip, in base alla velocità effettivadesiderata 4,5.
In questo protocollo, abbiamo descritto la procedura di progettazione e fabbricazione di un dispositivo microfluidico, che consiste di 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche migliorate e modulo di miscelazione in loco. La camera di coltura cellulare a 2 livelli previene il taglio non necessario durante lo scambio medio, il che garantisce un ambiente di coltura indisturbato per l’imaging di cellule vive a lungo termine. Gli studi dimostrano che il dispositivo microfluidico proposto è una piattaforma adatta per studi ad alta produttività sui macchinari di vita complessi. Inoltre, le caratteristiche avanzate del chip microfluidico consentono la ricostituzione automatizzata di condizioni microambientali altamente complesse e dinamiche in vivo, come le composizioni di citochine e ligandi in costanteevoluzione 6,7, il cui completamento richiede mesi per piattaforme convenzionali come la piastra a 96 pozzetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vari dispositivi microfluidici sono stati sviluppati per eseguire esperimenti multiplexati e complessi17,18,19,20. Ad esempio, i microwell fatti di una serie di recessi topologici possono intrappolare singole cellule senza l’uso di forza esterna, mostrando caratteri vantaggiosi tra cui piccole dimensioni del campione, parallelizzazione, minor costo del materiale, risposta più…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il supporto tecnico di Zhifeng Cheng di Chansn Instrument (China) LTD. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
