Generering av dynamiske miljøforhold ved hjelp av en mikrofluidisk enhet med høy gjennomstrømning
Summary
Vi presenterer et mikrofluidisk system for studier med høy gjennomstrømning på komplekse livsmaskiner, som består av 1500 kulturenheter, en rekke forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodul på stedet. Den mikrofluidiske brikken gjør det mulig å analysere de svært komplekse og dynamiske mikro-miljøforholdene in vivo.
Abstract
Etterligning av miljømessige forhold i vivo er avgjørende for in vitro-studier på komplekse livsmaskiner. Imidlertid er dagens teknikker rettet mot levende celler og organer enten svært dyre, som robotikk, eller mangler nanolitervolum og millisekunders tidsnøyaktighet i væskemanipulering. Vi presenterer heri design og fabrikasjon av et mikrofluidisk system, som består av 1500 kulturenheter, en rekke forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. For å demonstrere kapasiteten til den mikrofluidiske enheten opprettholdes nevrale stamceller (NSC) i det foreslåtte systemet. Vi observerte at når NSC-sfæren er utsatt for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, opprettholdes den rundformede konformasjonen godt. Variasjon i inngangsrekkefølgen til 6 legemidler forårsaker morfologiske endringer i NSC-sfæren og uttrykksnivårepresentantmarkøren for NSC-stemness (dvs. Hes5 og Dcx). Disse resultatene indikerer at dynamiske og komplekse miljøforhold har store effekter på NSC-differensiering og selvfornyelse, og den foreslåtte mikrofluidiske enheten er en egnet plattform for studier med høy gjennomstrømning på det komplekse livsmaskineriet.
Introduction
Høy gjennomstrømningsteknikker er avgjørende for biomedisinske og kliniske studier. Ved å parallelt gjennomføre millioner av kjemiske, genetiske eller levende celle- og organoidtester, kan forskere raskt identifisere gener som modulerer en biomolekylær vei, og tilpasse sekvensielle legemiddelinnganger til ens spesifikke behov. Robotikk1 og mikrofluidiske sjetonger i kombinasjon med et enhetskontrollprogram gjør det mulig å automatisere komplekse eksperimentelle prosedyrer som dekker celle/vev-manipulering, væskehåndtering, avbildning og databehandling/kontroll2,3. Derfor kan hundrevis og tusenvis av eksperimentelle forhold opprettholdes på en enkelt brikke, i henhold til ønsket gjennomstrømning4,5.
I denne protokollen beskrev vi design- og fabrikasjonsprosedyren til en mikrofluidisk enhet, som består av 1500 kulturenheter, en rekke forbedrede peristaltiske pumper og blandingsmodulus på stedet. Cellekulturkammeret på to nivåer forhindrer unødvendig skjær under mellombytte, noe som sikrer et uforstyrret kulturmiljø for langsiktig levende celleavbildning. Studiene viser at den foreslåtte mikrofluidiske enheten er en egnet plattform for studier med høy gjennomstrømning på det komplekse livsmaskineriet. Videre tillater de avanserte egenskapene til den mikrofluidiske brikken automatisert rekonstituering av svært komplekse og dynamiske mikromiljøforhold i vivo, som de stadig skiftende cytokiner og ligander komposisjoner6,7, hvis ferdigstillelse tar måneder for konvensjonelle plattformer som 96-brønns plate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ulike mikrofluidiske enheter er utviklet for å utføre multipleksede og komplekse eksperimenter17,18,19,20. Mikrowells laget av en rekke topologiske fordypninger kan for eksempel fange individuelle celler uten bruk av ekstern kraft, som viser fordelaktige tegn, inkludert liten prøvestørrelse, parallellisering, lavere materialkostnad, raskere respons, høy følsomhet21…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere anerkjenner teknisk støtte fra Zhifeng Cheng fra Chansn Instrument (China) LTD. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
