Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento
Summary
Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.
Abstract
Imitar condições ambientais in vivo é crucial para estudos in vitro sobre máquinas de vida complexas. No entanto, as técnicas atuais voltadas para células e órgãos vivos são altamente caras, como a robótica, ou não têm volume de nanoliter e precisão de tempo de milissegundos na manipulação líquida. Nós apresentamos aqui o design e a fabricação de um sistema microfluido, que consiste em 1.500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. Para demonstrar as capacidades do dispositivo microfluido, as esferas de células-tronco neurais (NSC) são mantidas no sistema proposto. Observamos que quando a esfera NSC é exposta à CXCL no primeiro dia e eGF no dia 2, a conformação em forma redonda é bem mantida. A variação na ordem de entrada de 6 medicamentos causa alterações morfológicas na esfera NSC e no marcador representativo do nível de expressão para a hasteza NSC (ou seja, Hes5 e Dcx). Esses resultados indicam que as condições ambientais dinâmicas e complexas têm grandes efeitos na diferenciação e autoconexão do NSC, e o dispositivo microfluido proposto é uma plataforma adequada para estudos de alto rendimento sobre as máquinas de vida complexa.
Introduction
Técnicas de alto rendimento são cruciais para estudos biomédicos e clínicos. Ao conduzir paralelamente milhões de testes químicos, genéticos ou de células vivas e organoides, os pesquisadores podem identificar rapidamente genes que modulam uma via bio molecular e personalizar a entrada de drogas sequenciais às necessidades específicas. Os chips robóticos1 e microfluidic em combinação com um programa de controle de dispositivos permitem que procedimentos experimentais complexos sejam automatizados, abrangendo manipulação celular/tecido, manuseio líquido, imagem e processamento/controle de dados2,3. Portanto, centenas e milhares de condições experimentais podem ser mantidas em um único chip, de acordo com o rendimento desejado4,5.
Neste protocolo, descrevemos o procedimento de design e fabricação de um dispositivo microfluido, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e módulos de mistura no local. A câmara de cultura celular de 2 níveis previne uma tesoura desnecessária durante a troca média, o que garante um ambiente cultural não perturbado para imagens de células vivas de longo prazo. Os estudos demonstram que o dispositivo microfluido proposto é uma plataforma adequada para estudos de alto rendimento sobre as complexas máquinas de vida. Além disso, as características avançadas do chip microfluido permitem a reconstituição automatizada de condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo, como as composições de citocinas e ligantes em troca6,7,a conclusão das quais leva meses para plataformas convencionais como placa de 96 poços.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários dispositivos microfluidos foram desenvolvidos para realizar experimentos multiplexados e complexos17,18,19,20. Por exemplo, microwells feitas de uma matriz de recessos topológicos podem prender células individuais sem o uso de força externa, mostrando caracteres vantajosos, incluindo pequeno tamanho amostral, paraleloização, menor custo de material, resposta mais rápida, alta sens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio técnico de Zhifeng Cheng da Chansn Instrument (China) LTD. Este trabalho foi apoiado por bolsas (Fundação Nacional de Ciência Natural da China,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
