Поколение динамических экологических условий с использованием микрофлюидного устройства с высокой пропускной способностью
Summary
Мы представляем микрофлюидную систему для высокой пропускной способности исследований на сложных жизненных механизмов, которая состоит из 1500 единиц культуры, массив расширенных перистальтических насосов и на месте смешивания модуль. Микрофлюидный чип позволяет проводить анализ очень сложных и динамичных микро-экологических условий in vivo.
Abstract
Имитация условий окружающей среды in vivo имеет решающее значение для исследований in vitro по сложному жизненному механизму. Тем не менее, современные методы ориентации живых клеток и органов либо очень дорого, как робототехника, или отсутствие нанолитрового объема и миллисекундной точности времени в жидких манипуляций. Здесь мы представляем дизайн и изготовление микрофлюидной системы, которая состоит из 1500 единиц культуры, массив расширенных перистальтических насосов и на месте смешивания модуль. Для демонстрации возможностей микрофлюидного устройства в предлагаемой системе поддерживаются сферы нервных стволовых клеток (НСК). Мы заметили, что, когда сфера НСК подвергается воздействию CXCL в день 1 и EGF в день 2, круглая конформация в хорошо поддерживается. Изменение порядка ввода 6 препаратов вызывает морфологические изменения в сфере НСК и репрезентативный маркер уровня экспрессии для стволов НСК (т.е. Hes5 и Dcx). Эти результаты свидетельствуют о том, что динамические и сложные условия окружающей среды имеют большое влияние на дифференциацию и самообувечение НСК, а предлагаемое микрофлюидное устройство является подходящей платформой для высокой пропускной способности исследований на сложном жизненном механизме.
Introduction
Высокие методы пропускной способности имеют решающее значение для биомедицинских и клинических исследований. Параллельно проводя миллионы химических, генетических или живых клеток и органоидных тестов, исследователи могут быстро определить гены, которые модулируют био-молекулярный путь, и настроить последовательные ввода наркотиков для своих конкретных потребностей. Робототехника1 и микрофлюидные чипы в сочетании с программой управления устройством позволяют автоматизировать сложные экспериментальные процедуры, охватывающие манипуляции с клетками/тканями, обработку жидкости, визуализацию и обработку/контрольданных 2,3. Таким образом, сотни и тысячи экспериментальных условий могут быть сохранены на одном чипе, в соответствии с желаемойпропускной способностью 4,5.
В этом протоколе мы описали процедуру проектирования и изготовления микрофлюидного устройства, которое состоит из 1500 единиц культуры, массива усовершенствованные перистальтические насосы и на месте смешивания модуль. 2-уровневая камера клеточной культуры предотвращает ненужный слейр во время среднего обмена, что обеспечивает нетронутую культурную среду для долгосрочной визуализации живых клеток. Исследования показывают, что предлагаемое микрофлюидное устройство является подходящей платформой для высокой пропускной способности исследований на сложном жизненном механизме. Кроме того, расширенные характеристики микрофлюидного чипа позволяют автоматически воссоздать очень сложные и динамичные микроэнвиронные условия in vivo, такие как постоянно меняющиеся цитокиныи лиганды композиций 6,7, завершение которых занимает месяцы для обычных платформ, таких как 96-хорошо пластины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработаны различные микрофлюидные устройства для выполнения мультиплексированных исложных экспериментов 17,18,19,20. Например, микроуэллы из массива топологических углублений могут ловушку отдельных клеток без исп?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают техническую поддержку со стороны Чжифэн Чэн из Chansn Instrument (Китай) LTD. Эта работа была поддержана грантами (Национальный фонд естественных наук Китая,51927804).
Materials
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
