Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе
Summary
Мы представляем два различных протокола окрашивания для обнаружения лиганда NKG2D (NKG2DL) в образцах первичного острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) человека. Первый подход основан на слиянии белка, способного распознавать все известные и потенциально еще неизвестные лиганды, в то время как второй протокол основан на добавлении нескольких антител против NKG2DL.
Abstract
Было показано, что отсутствие поверхностной экспрессии лигандов NKG2D (NKG2DL) отличает лейкемические субпопуляции со свойствами стволовых клеток (так называемые лейкемические стволовые клетки, LSC) от более дифференцированных аналогов лейкемических клеток, которые не имеют потенциала инициации заболевания, хотя они несут аналогичные специфические генетические мутации лейкемии. NKG2DL являются биохимически очень разнообразными MHC класса I-подобными самомолекулярными молекулами. Здоровые клетки в гомеостатических условиях обычно не экспрессирует NKG2DL на поверхности клеток. Вместо этого экспрессия этих лигандов индуцируется при воздействии клеточного стресса (например, онкогенной трансформации или инфекционных стимулов), чтобы вызвать устранение поврежденных клеток посредством лизиса через NKG2D-рецептор-экспрессировающие иммунные клетки, такие как естественные киллеры (NK) клетки. Интересно, что поверхностная экспрессия NKG2DL избирательно подавляется в субпопуляциях LSC, что позволяет этим клеткам уклоняться от NKG2D-опосредованного иммунного надзора. Здесь мы представляем параллельный анализ двух различных методов проточной цитометрии, которые позволяют исследуть поверхностную экспрессию NKG2DL на раковых клетках, то есть метод, включающий распознавание панлигандов, и метод, включающий окрашивание несколькими антителами против отдельных лигандов. Эти методы могут быть использованы для отделения жизнеспособных отрицательных клеточных субпопуляций NKG2DL с предполагаемой свойствами раковых стволовых клеток от NKG2DL положительных не-LSC.
Introduction
NK-клетки являются важными эффекторами врожденной иммунной системы, которые могут распознавать и устранять злокачественные клетки или стрессовые здоровые клетки (например, вирусной инфекцией) без предварительной стимуляции антигена1. Этот процесс жестко регулируется с помощью сложного репертуара активирующих рецепторов, таких как естественные рецепторы цитотоксичности (NCR), NKG2D и CD16, и ингибирующих рецепторов, которые в значительной степени представлены иммуноглобулиноподобными рецепторами-киллерами (KIRs)2. Связывание KIRs с молекулами лейкоцитарного антигена человека (HLA) класса I на соматических клетках обеспечивает самораспознавание и передает толерантность NK-клеток. С другой стороны, отсутствие самораспознавания и повышенное связывание активирующих рецепторов с их лигандами на клетках-мишенях вызывают высвобождение цитотоксических гранул, приводящих к NK-клеточной опосредорованию цитотоксичностью1. Наконец, NK-клетки могут оказывать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) путем связывания активирующего рецептора CD16 с мишенями, экспрессирующими Fc-часть Ig(FcR)2. Помимо прямой цитотоксичности, NK-клетки также могут вызывать высвобождение цитокинов, соединяющее врожденную с адаптивной иммунной системой3.
NKG2D является основным активирующим рецептором, экспрессируемым на NK, NKT, γδ T и наивных CD8 + Т-клетках4, который позволяет таким цитотоксическим иммунным клеткам распознавать и лизировать лиганд NKG2D (NKG2DL), экспрессирующий клетки-мишени. Здоровые клетки обычно не экспрессивают NKG2DL. Вместо этого экспрессия NKG2DL регулируется на злокачественных или инфицированных вирусом клетках, чтобы сделать их поддаются иммунному клиренсу5.
Человеческое семейство NKG2DL включает восемь известных молекул, среди которых две связанные с цепью MHC I молекулы A и B (MICA и MICB6)и цитомегаловирус UL16-связывающие белки 1-6 (ULBP1-67). Выражение NKG2DL регулируется на транскрипционном, посткриптиционном, а также постпереводяном уровнях8. Таким образом, в то время как экспрессия NKG2DL обычно не обнаруживается на поверхности здоровых клеток, мРНК NKG2DL9 и внутриклеточная экспрессия белка были зарегистрированы в здоровых тканях. Функциональная значимость такого выражения и механизмы, лежащие в основе таких дискрепрепантных паттернов выражения, еще предстоит определить10.
Механистическая регуляция экспрессии NKG2DL в раковых клетках является увлекательной областью исследования. Пути, которые, как известно, участвуют либо в клеточном стрессе, например, в пути стресса теплового шока9,либо в пути, связанные с повреждением ДНК, такие как мутировавший телеангиэктазия атаксии (ATM) и связанный с Rad3 (ATR)путь 11,а также вирусные или бактериальные инфекции были напрямую связаны с индудукцией экспрессии NKG2DL12. Однако, даже если поверхностная экспрессия NKG2DL была эффективно индуцирована, эта экспрессия может быть снова потеряна через протеолитически-опосредованную линьку, механизм, связанный с иммунным побегом и плохим клиническим прогнозом при некоторых видах рака13.
Отсутствие клеточной поверхности NKG2DL также может играть важную роль у пациентов с ОМЛ. Здесь лечение интенсивной химиотерапией часто вызывает ремиссию, но рецидив часто возникает от лейкемических стволовых клеток (LSC), которые избирательно переживают химиотерапию и уклоняются от иммунного ответа. Как мы недавно показали, LSC, например, избегают лизиса NK-клеток, подавляя поверхностную экспрессию NKG2DL14.
И наоборот, отсутствие поверхностной экспрессии NKG2DL может быть использовано в качестве метода для идентификации и жизнеспособного выделения предполагаемой стволоподобной субпопуляции клеток от объемных аналогов лейкемических субпопуляций. Здесь мы представляем два проточных цитометрических подхода, которые могут быть использованы для обнаружения поверхностной экспрессии NKG2DL и тем самым идентификации отрицательных стволовых клеток NKG2DL при лейкемии и, возможно, также при других видах рака: метод распознавания поверхности панлиганда и метод, включающий окрашивание одиночными или объединенными антителами, распознающими отдельные известные белки NKG2DL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем два метода проточной цитометрии, которые могут обнаруживать поверхностную экспрессию NKG2DL на первичных клетках AML человека. Показано, что оба метода обнаружения могут быть использованы в сочетании с другими окрашиваниями антител (например, обнаружение экспрессии…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Швейцарского национального научного фонда (179239), Фонда борьбы с раком (Zuerich), Фонда Вильгельма Сандера для CL (2019.042.1) и Фонда медико-биологических исследований Novartis для C.L. Кроме того, этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 765104. Мы благодарим Центр проточной цитометрии в Базеле за поддержку.
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: “One for All, All for One”. Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
