急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ
Summary
ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。
Abstract
同じ患者内で、NKG2Dリガンド(NKG2DL)表面発現の欠如は、同様の白血病特異的遺伝子変異を有するが疾患開始可能性を欠く、より分化された白血病細胞と幹細胞特性(いわゆる白血病幹細胞、LSC)を有する白血病亜集団を区別することが示された。NKG2DLは、生化学的に多様なMHCクラスI型自己分子です。恒常性状態の健康な細胞は、一般に、細胞表面上でNKG2DLを発現しない。その代わりに、これらのリガンドの発現は、細胞ストレス(例えば、発癌性転換または感染性刺激)への曝露時に誘導され、ナチュラルキラー(NK)細胞などのNKG2D受容体発現免疫細胞を介してライシスを介して損傷した細胞の排除を引き起こす。興味深いことに、NKG2DL表面発現はLSC亜集団において選択的に抑制され、これらの細胞はNKG2D媒介性免疫監視を回避することを可能にする。ここでは、がん細胞上でのNKG2DL表面発現の解析を可能にする2つの異なるフローサイトメトリー法、すなわち汎リガンド認識を含む方法、および単一リガンドに対する複数の抗体による染色を含む方法を並べて分析する。これらの方法は、NKG2DL陽性非LSCから推定癌幹細胞特性を有する生存可能なNKG2DL陰性細胞亜集団を分離するために使用することができる。
Introduction
NK細胞は、予め抗原刺激を伴わずに悪性細胞またはストレスを受けた健康な細胞(例えばウイルス感染によって)を認識・排除することができる自然免疫系の重要なエフェクターである。このプロセスは、天然細胞毒性受容体(NDR)、NKG2DおよびCD16などの活性化受容体の複雑なレパートリーと、主にキラー免疫グロブリン様受容体(KIRs)2によって表される阻害受容体を介して厳しく調節される。体細胞上のヒト白血球抗原(HLA)クラスI分子へのKIRsの結合は自己認識を保障し、NK細胞耐性を伝える。一方、自己認識の欠如および標的細胞上のそれらのリガンドへの活性化受容体の結合の増加は、NK細胞媒介細胞傷害性1につながる細胞傷害性顆粒の放出を引き起こす。最後に、NK細胞は、活性化受容体CD16をIg(FcR)2のFc部分を発現する標的に結合することにより、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を発揮することができる。直接的な細胞傷害性とは別に、NK細胞はまた、適応免疫系3と自然をつなぎサイトカイン放出を引き起こすことができる。
NKG2DはNK、NKT、γδT、およびナイーブCD8+T細胞4 上で発現される主要な活性化受容体であり、そのような細胞傷害性免疫細胞がNKG2Dリガンド(NKG2DL)を認識およびライゼすることを可能にする標的細胞である。健康な細胞は一般にNKG2DLを発現しない。代わりに、NKG2DL発現は悪性細胞またはウイルス感染細胞上でアップレギュレートされ、免疫クリアランス5に対してこれらを受け入れ可能にする。
ヒトNKG2DLファミリーは、2つのMHC I鎖関連分子AおよびB(MICAおよびMICB6)およびサイトメガロウイルスUL16結合タンパク質1~6(ULBP1-67)を含む8つの既知の分子から構成される。NKG2DLの発現は、転写、転写後、およびトランスレーショナル後レベル8で調節される。このように、NKG2DL発現は一般に健康な細胞の表面では検出できないが、NKG2DL mRNA9 および細胞内タンパク質発現は健康組織において報告された。このような式の機能的関連性と、このような不定式表現パターンの基礎となるメカニズムは、10に定義されたままである。
がん細胞におけるNKG2DL発現の機構調節は、魅力的な研究分野です。細胞ストレスのいずれかに関与することが知られている経路、例えば、熱ショックストレス経路9、または変異した運動失調性血管拡張症(ATM)およびRad3関連(ATR)経路11などのDNA損傷関連経路、ならびにウイルスまたは細菌感染がNKG2DL発現12の誘導に直接関連している。しかし、たとえNKG2DLの表面発現が効果的に誘導されたとしても、この発現は、タンパク質分解媒介性脱落を通じて再び失われ得る、一部の癌13における免疫脱出および悪い臨床予後に関連するメカニズムである。
細胞表面NKG2DLの不在は、AML患者において重要な役割を果たす可能性もある。ここで、集中的な化学療法による治療はしばしば寛解を誘発するが、再発はしばしば白血病幹細胞(LSC)から起こり、化学療法を選択的に生き残り、免疫応答を回避する。我々が最近示したように、LSCは、例えば、NKG2DL表面発現14を抑制することによってNK細胞のリシスを逃れる。
逆に、表面NKG2DL発現の欠如は、バルク対応白血病亜集団から細胞の推定茎様部分集団を同定し、生存可能に単離する方法として使用することができる。ここでは、NKG2DL表面発現を検出し、白血病および他の癌においてもNKG2DL陰性幹細胞を同定するために使用できる2つのフローサイトメトリックアプローチを提示する:汎リガンド表面認識のための方法および既知のNKG2DLタンパク質を認識する単一またはプール抗体による染色を含む方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ヒトの原生AML細胞上でNKG2DL表面発現を検出できる2つのフローサイトメトリック法を紹介する。我々は、両方の検出方法が他の抗体染色(例えば、CD34発現を検出する)と組み合わせて使用できることを示す。同様の染色は、他の一次細胞型および細胞株にも行うことができる。
我々は最近、AML患者の爆風の表面にNKG2DLの不在がLSC14を豊かにする?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スイス国立科学財団(179239)、がんとの闘いのための財団(チューリッヒ)、ウィルヘルム・サンダー財団からCL(2019.042.1)、ノバルティス医学生物学研究財団からの助成金によって支援されました。さらに、このプロジェクトは、マリー・スクウォドフスカ・キュリー交付金第765104の下で、欧州連合のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。バーゼルのフローサイトメトリー施設にサポートを感謝します。
Materials
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) – 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
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