4T1 स्तन कैंसर मॉडल में फेफड़ों के मेटास्टेसिस के क्वांटिफिकेशन में सुधार करने के लिए कंप्यूटर आधारित छवि विश्लेषण का उपयोग करना
Summary
हम फिजी-इमेजजे का उपयोग करके 4T1 स्तन कैंसर मॉडल में फेफड़ों के मेटास्टेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अधिक सुसंगत और त्वरित विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
स्तन कैंसर एक विनाशकारी द्रोह है, ४०,००० महिला मौतों और संयुक्त राज्य अमेरिका में नई महिला कैंसर निदान के 30% के लिए लेखांकन अकेले २०१९ में । स्तन कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण मेटास्टैटिक बोझ है। इसलिए, स्तन कैंसर के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल को चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक होने के लिए मेटास्टैटिक बोझ का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। 4T1 स्तन कैंसर मॉडल चरण चतुर्थ मानव स्तन कैंसर के लिए एक अनायास-मेटास्टेसिंग, मात्रात्मक माउस मॉडल प्रदान करता है । हालांकि, अधिकांश 4T1 प्रोटोकॉल ऊतक संस्कृति प्लेटों पर मैन्युअल रूप से दाग वाली कॉलोनियों की गणना करके मेटास्टैटिक बोझ की मात्रा निर्धारित करते हैं। हालांकि यह कम मेटास्टैटिक बोझ वाले ऊतकों के लिए पर्याप्त है, मैनुअल गिनती में मानव त्रुटि असंगत और चर परिणाम का कारण बनती है जब प्लेटें भ्रमित होती हैं और गिनती करना मुश्किल होता है। यह विधि मानव गणना त्रुटि के लिए एक कंप्यूटर आधारित समाधान प्रदान करता है। यहां, हम फेफड़ों, 4T1 मॉडल में एक अत्यधिक मेटास्टैटिक ऊतक का उपयोग कर प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करते हैं। मेथिलीन नीले दाग प्लेटों की छवियां फिजी-इमेजजे में विश्लेषण के लिए अधिग्रहीत और अपलोड की गई हैं। फिजी-इमेजजे तब छवि के चयनित क्षेत्र का प्रतिशत निर्धारित करता है जो नीला है, जो मेटास्टैटिक बोझ के साथ प्लेट के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। यह कंप्यूटर-आधारित दृष्टिकोण अत्यधिक मेटास्टैटिक ऊतकों के लिए मैनुअल गिनती या हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन की तुलना में अधिक सुसंगत और त्वरित परिणाम प्रदान करता है। फिजी-इमेजजे परिणामों की स्थिरता छवि की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। छवियों के बीच परिणामों में मामूली भिन्नताएं हो सकती हैं, इस प्रकार यह सिफारिश की जाती है कि कई छवियां ली जाती हैं और परिणाम औसत होते हैं। अपनी न्यूनतम सीमाओं के बावजूद, यह विधि लगातार और तेजी से परिणाम देकर फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ की मात्रा निर्धारित करने में सुधार है।
Introduction
आठ महिलाओं में से एक अपने जीवनकाल में स्तन कैंसर के साथ का निदान किया जाएगा, और अभी तक कई उपचार के विकल्प के बावजूद स्तन कैंसर अमेरिकी महिलाओं में कैंसर से संबंधित मौतों का दूसरा प्रमुख कारण है1। ये महिलाएं अपने स्तन में प्राथमिक ट्यूमर से नहीं मर रही हैं। इसके बजाय, मेटास्टैटिक बोझ इस बीमारी की मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार है क्योंकि यह आमतौर पर फेफड़े, हड्डी, मस्तिष्क, यकृत और लिम्फ नोड्स2में फैलता है। इस वजह से, स्तन कैंसर मॉडल इस बीमारी की मृत्यु दर को रोकने में योगदान करने के लिए मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने की जरूरत है । 4T1 murine स्तन कैंसर मॉडल इसे पूरा करने के लिए एक शानदार प्रोटोकॉल है। यहां वर्णित विधि फिजी-इमेजजे का उपयोग करके फेफड़ों के मेटास्टेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए 4T1 मॉडल में सुधार प्रदान करती है, जो लगातार और त्वरित परिणाम पैदा करती है।
4T1 मॉडल अच्छी तरह से स्थापित है, जिसमें अधिकांश प्रयोगशालाएं प्रोटोकॉल का उपयोग कर रही हैं जैसे कि पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग द्वारा 20013में वर्णित हैं। 4T1 सेल लाइन 6-थिओगुआनिन (6TG) प्रतिरोधी और स्टेज IV, ट्रिपलनिगेटिव ब्रेस्ट कैंसर3,4,5का प्रतिनिधि है। यह चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह एक आर्थोटोपिक मॉडल है और अनायास ही अंगों को मेटास्टेसाइज करता है जैसा कि मानव स्तन कैंसरमें 3, 4,4. 4T1 कोशिकाएं अनायास ही3,4कोशिकाओं की मात्रा के आधार पर अनुमानित दर पर मेटास्टेसाइज करती हैं . महत्वपूर्ण बात, यहां इस्तेमाल चूहों के बीच आनुवंशिक मतभेद मेटास्टैटिक बोझ में अपेक्षित अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का कारण बना। मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने के लिए, ऊतकों को 6TG चयन और मेथिलीन ब्लू धुंधला का उपयोग करके दूर की साइटों में कैंसर कोशिकाओं को इकट्ठा करने और निर्धारित करने के लिए काटा जाता है। परिणाम मेटास्टैटिक उपनिवेशों का प्रतिनिधित्व करने वाले नीले बिंदुओं के साथ ऊतक संस्कृति प्लेटों का संग्रह है। हालांकि, पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग प्रोटोकॉल मैन्युअल रूप से उन्हें गिनकर मेटास्टैटिक उपनिवेशों का मात्रा बताते हैं, और इसलिए यह इस मॉडल में मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने का मानक साधन रहा है। हालांकि यह कम मेटास्टैटिक बोझ वाले ऊतकों के लिए आसान है, फेफड़ों जैसे ऊतक अक्सर मेटास्टेस से लदे होते हैं। चूंकि फेफड़ों की प्लेटें अत्यधिक संकुचित हो सकती हैं, सही और सटीक रूप से मैनुअल गिनती द्वारा मेटास्टैटिक उपनिवेशों को मात्राबद्ध करना मुश्किल है और मानवीय त्रुटि से ग्रस्त है। मेटास्टैटिक बोझ को बेहतर तरह से निर्धारित करने के लिए, हम मानव गणना त्रुटि के कंप्यूटर-आधारित समाधान के लिए फिजी-इमेजजे का उपयोग करने का वर्णन करते हैं। हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) धुंधला के साथ हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण फेफड़ों के मेटास्टेस को निर्धारित करने का एक और साधन है, और दिलचस्प रूप से फिजी-इमेजजे सॉफ्टवेयर6,7के साथ भी सुधार किया गया है। हालांकि, क्योंकि हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण फेफड़ों का एक टुकड़ा देखता है, यह गलत और प्रतिनिधि हो सकता है। इसका कारण यह है कि 4T1 मॉडल पूरे अंग में कई मेटास्टैटिक घावों का कारण बनता है जो समान रूप से वितरित नहीं होते हैं। जबकि हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण और मैनुअल गिनती के बीच समग्र रुझान समान8हो सकते हैं, व्यक्तिगत मूल्य अलग हो सकते हैं और इसलिए हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण को मात्राकरण के एकमात्र साधन के रूप में उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। हम हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण और विभिन्न काउंटरों के बीच मैनुअल गिनती में विसंगतियों की तुलना में लाभ प्रदर्शित करते हैं, जबकि फिजी-इमेजजे का उपयोग करने की निरंतरता का भी प्रदर्शन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम बताते हैं कि यह विधि इनक्यूबेशन समय को 10-14 दिनों से घटाकर 5 दिनों तक कर सकती है, जिसका अर्थ है कि शोधकर्ता मैनुअल गिनती पर भरोसा करते समय अपने अध्ययन से डेटा का विश्लेषण कर सकते हैं।
यह विधि पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग प्रोटोकॉल3के लिए सरल समायोजन का संग्रह है। क्योंकि 4T1 मॉडल व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है, और क्योंकि फेफड़ों के मेटास्टेसिस पूर्व नैदानिक मॉडल में मापने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, हमारा मानना है कि इस विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है और स्तन कैंसर शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक मूल्यवान है। केवल अतिरिक्त आपूर्ति की आवश्यकता एक कैमरा और फिजी-इमेजजे के साथ कंप्यूटर तक पहुंच है, जो छवि विश्लेषण9में अक्सर उपयोग किया जाने वाला एक मुफ्त सॉफ्टवेयर है। यह विधि विशेष रूप से फेफड़ों के मेटास्टेसिस पर केंद्रित है, लेकिन इसका उपयोग महत्वपूर्ण मेटास्टैटिक बोझ वाले अन्य ऊतकों के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, प्रत्येक फेफड़ों की प्लेट पर मेटास्टैटिक उपनिवेशों की मैन्युअल रूप से गिनती फेफड़ों के मेटास्टेसिस को निर्धारित करने के लिए एक गलत और सटीक विधि हो सकती है, जो मात्राकरण<stron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को वर्जीनिया-मैरीलैंड कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन (आईए), वर्जीनिया टेक इंस्टीट्यूट फॉर क्रिटिकल टेक्नोलॉजी और एप्लाइड साइंस सेंटर फॉर इंजीनियर हेल्थ (आईए) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ R21EB028429 (आईए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
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