Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Summary

Descrevemos um método mais consistente e rápido para quantificar a metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 usando Fiji-ImageJ.

Abstract

O câncer de mama é uma malignidade devastadora, representando 40.000 mortes de mulheres e 30% de novos diagnósticos de câncer feminino nos Estados Unidos apenas em 2019. A principal causa de mortes relacionadas ao câncer de mama é a carga metastática. Portanto, modelos pré-clínicos para o câncer de mama precisam analisar a carga metastática para serem clinicamente relevantes. O modelo de câncer de mama 4T1 fornece um modelo de camundongos espontaneamente metástase e quantificável para o câncer de mama humano estágio IV. No entanto, a maioria dos protocolos 4T1 quantificam a carga metastática contando manualmente colônias manchadas em placas de cultura tecidual. Embora isso seja suficiente para tecidos com menor carga metastática, o erro humano na contagem manual causa resultados inconsistentes e variáveis quando as placas são confluentes e difíceis de contar. Este método oferece uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. Aqui, avaliamos o protocolo usando o pulmão, um tecido altamente metastático no modelo 4T1. Imagens de placas manchadas de azul de metileno são adquiridas e enviadas para análise em Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ então determina a porcentagem da área selecionada da imagem que é azul, representando a porcentagem da placa com carga metastática. Esta abordagem baseada em computador oferece resultados mais consistentes e rápidos do que a contagem manual ou a avaliação histopatológica para tecidos altamente metastáticos. A consistência dos resultados do Fiji-ImageJ depende da qualidade da imagem. Pequenas variações nos resultados entre as imagens podem ocorrer, assim é recomendável que várias imagens sejam tiradas e os resultados sejam mediados. Apesar de suas limitações mínimas, este método é uma melhoria para quantificar a carga metastática no pulmão, oferecendo resultados consistentes e rápidos.

Introduction

Uma em cada oito mulheres será diagnosticada com câncer de mama em sua vida, e ainda apesar de múltiplas opções de tratamento, o câncer de mama é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres americanas¹. Essas mulheres não estão morrendo pelo tumor primário na mama. Em vez disso, a carga metastática é responsável pela mortalidade desta doença, pois comumente se espalha para o pulmão, osso, cérebro, fígado e linfonodos². Por isso, os modelos de câncer de mama precisam avaliar a metástase para contribuir para conter a mortalidade dessa doença. O modelo de câncer de mama murine 4T1 é um excelente protocolo para conseguir isso. O método descrito aqui oferece uma melhoria para o modelo 4T1 usando Fiji-ImageJ para quantificar a metástase pulmonar, produzindo resultados consistentes e rápidos.

O modelo 4T1 é bem estabelecido, com a maioria dos laboratórios usando protocolos como os descritos por Pulaski e Ostrand-Rosenberg em 2001³. A linha celular 4T1 é resistente à 6-Thioguanina (6TG) e representativa do estágio IV, câncer de mama triplo negativo^3,4,5. É clinicamente relevante por ser um modelo ortotópico e metástase espontaneamente aos mesmos órgãos do câncer de mama humano^3,4. As células 4T1 metástases espontaneamente a uma taxa previsível com base na quantidade de células injetadas^3,4. É importante ressaltar que as diferenças genéticas entre os camundongos aqui utilizados causaram a variabilidade inter-individual esperada na carga metastática. Para avaliar a metástase, os tecidos são colhidos para coletar e quantificar células cancerígenas em locais distantes usando seleção de 6TG e coloração azul de metileno. O resultado é uma coleção de placas de cultura tecidual com pontos azuis representando colônias metastáticas. No entanto, o protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica as colônias metastáticas contando-as manualmente, e, portanto, este tem sido o meio padrão de avaliar a metástase neste modelo. Embora isso seja fácil para tecidos com baixa carga metastática, tecidos como os pulmões são frequentemente carregados de metástases. Como as placas pulmonares podem ser altamente confluentes, quantificar com precisão e precisão colônias metastáticas por contagem manual é difícil e propenso a erros humanos. Para quantificar melhor a carga metastática, descrevemos o uso do Fiji-ImageJ para uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. A análise histopatológica com hematoxilina e eosina (H&E) é outro meio de quantificar metástases pulmonares, e curiosamente também foi melhorada com o software Fiji-ImageJ^6,7. No entanto, como a análise histopatológica observa uma única fatia do pulmão, pode ser imprecisa e não representativa. Isso porque o modelo 4T1 causa várias lesões metastáticas em todo o órgão que não são distribuídas uniformemente. Embora as tendências globais entre a análise histopatológica e a contagem manual possam ser^{semelhantes 8,}os valores individuais podem diferir e, portanto, a análise histopatológica não deve ser usada como único meio de quantificação. Demonstramos o benefício em comparação com a análise histopatológica e as inconsistências na contagem manual entre diferentes contadores, ao mesmo tempo em que demonstramos a consistência do uso do Fiji-ImageJ. Além disso, mostramos que esse método pode reduzir o tempo de incubação de 10-14 dias para 5 dias, o que significa que os pesquisadores podem analisar dados de seu estudo muito mais cedo do que quando se baseia na contagem manual.

Este método é uma coleção de ajustes simples ao protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg³. Como o modelo 4T1 é amplamente utilizado, e como a metástase pulmonar é um parâmetro crítico para medir em modelos pré-clínicos, acreditamos que esse método pode ser amplamente utilizado e é altamente valioso para os pesquisadores de câncer de mama. Os únicos suprimentos adicionais necessários são uma câmera e acesso a um computador com Fiji-ImageJ, um software livre usado com frequência na análise de^{imagens 9}. Este método se concentra especificamente na metástase pulmonar, mas pode ser usado para outros tecidos com carga metastática significativa.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e de acordo com o Guia Nacional dos Institutos de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A realização deste protocolo requer permissão das instituições competentes e adesão a todas as diretrizes adequadas. 1. Cultura celular Faça mídia de cultura completa (RPMI + 10% soro bovino fetal +1% Pen Strep). Reviva células 4T1 de acordo c…

Representative Results

Este método contém ajustes simples do protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T13 e pode ser visualizado na Figura 1. Quando 3 pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas para 12 placas pulmonares (diluição de 1:10), os resultados foram muito inconsistentes entre diferentes contadores(Figura 2A). Todos os pesquisadores foram orientados a “contar as colônias metastáticas que aparecem como pontos azuis”, mas as…

Discussion

Como demonstrado, contar manualmente as colônias metastáticas em cada placa pulmonar pode ser um método impreciso e impreciso para quantificar a metástase pulmonar, demonstrando a necessidade de um melhor meio de quantificação(Figura 2). A análise histopatológica difere ligeiramente da contagem manual e da análise fiji-imageJ(Figura 2B e 4D),provavelmente porque os slides de H&E não são uma amostra representativa de todo o órgão. O …

Materials

Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
1 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water