Denne artikkelen presenterer en rekke påfølgende metoder for uttrykk og rensing av Salmonella typhimurium tryptofan synthase comp denne protokollen et raskt system for å rense proteinkomplekset på en dag. Dekkede metoder er stedsstyrt mutagenese, proteinuttrykk i Escherichia coli, affinitetskromatografi, gelfiltreringskromatografi og krystallisering.
Strukturelle studier med tryptofan synthase (TS) bienzymekompleks (α2β2 TS) fra Salmonella typhimurium har blitt utført for å bedre forstå sin katalytiske mekanisme, allosterisk oppførsel og detaljer om den enzymatiske transformasjonen av substrat til produkt i PLP-avhengige enzymer. I dette arbeidet tillot et nytt uttrykkssystem for å produsere de isolerte α- og isolerte β-underenhet rensing av høye mengder rene underenheter og α2β2StTS-komplekset fra de isolerte underenhetene innen 2 dager. Rensing ble utført av affinitetskromatografi etterfulgt av spalting av affinitetstaggen, ammoniumsulfatutfelling og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). For bedre å forstå rollen som viktige rester ved enzymet β stedet, ble steds-direkte mutagenese utført i tidligere strukturelle studier. En annen protokoll ble opprettet for å rense den ville typen og mutanten α2β2StTS-komplekser. En enkel, rask og effektiv protokoll ved hjelp av ammoniumsulfatfraksjonering og SEC tillot rensing av α2β2StTS-kompleks på en enkelt dag. Begge renseprotokollene beskrevet i dette arbeidet har betydelige fordeler sammenlignet med tidligere protokoller for å rense det samme komplekset ved hjelp av PEG 8000 og spermin for å krystallisere α2β2StTS-komplekset langs renselsesprotokollen. Krystallisering av vill type og noen mutante former skjer under litt forskjellige forhold, svekker rensingen av noen mutanter ved hjelp av PEG 8000 og spermin. For å forberede krystaller egnet for røntgenkrystallografiske studier ble det gjort flere anstrengelser for å optimalisere krystallisering, krystallkvalitet og kryoproteksjon. Metodene som presenteres her bør generelt gjelde for rensing av tryptofan synthase underenheter og vill type og mutant α2β2StTS komplekser.
Tryptofan syntase (TS) bienzymekomplekset (α2β2) er et allosterisk enzym, katalyserer de to siste trinnene i biosyntesen av aminosyren L-Tryptofan i bakterier, planter og sopp1,2,3. Bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) forårsaker en alvorlig gastrointestinal infeksjon hos mennesker og andre dyr. Siden mennesker og høyere dyr ikke har TS (EC 4.2.1.20), hemming av S. typhimurium α2β2 TS-kompleks (α2β2StTS) har blitt utforsket som et potensielt legemiddelmål for behandling av kryptosporidiose og tuberkulose4, kjønns- og okulære infeksjoner5, og for potensiell herbicidutnyttelse ilandbruket 6. Den α-subenhet katalyserer den aldolytiske spaltingen av indole-3-glyserol-fosfat (IGP) til glyseraldehyd-3-fosfat (GAP) og indole, gjennom dannelsen av en indolenin tautomer mellomliggende og deretter karbonkarbonbinding spalting for å produsere GAP og indole3,6. Det β-katalytiske stedet inneholder et pyridoksalt 5′-fosfat (PLP) kofaktormolekyl bundet til β-Lys87 via en Schiff-base, som fungerer som en elektron vask i løpet av reaksjonene ved enzymet β-subenhet3,7. Det β stedet katalyserer utskifting av L-Serine sidekjedehydroksyl med indole for å gi L-Tryptophan og et vannmolekyl i en PLP-avhengig reaksjon. St TS fungerer som en langvarig modell for undersøkelse av substratkanal og allosterisk kommunikasjon innen multienzymkomplekser2,3. Toveis allosterisk kommunikasjon mellom α- og β-underenheter av TS er nødvendig for å synkronisere katalytiske trinn og forhindre indole-frigjøring under L-Tryptophan syntese3. For å utvide denne innsatsen har vi forberedt flere mutanter (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr og β-Ser377Ala) ved enkeltpunktmutasjon som skal brukes i videre undersøkelser av forholdet mellom enzymstruktur, mekanisme og funksjon på det katalytiske stedet til StTS-β-underenheten.
Detaljert forskning på den katalytiske mekanismen til α2β2StTS ble initiert av forskningsgruppen Edith W. Miles. Tidlige studier med innfødt Escherichia coli α2β2 TS-komplekset har fokusert på rensing og karakterisering av den isolerte α-subenhet8,9, isolert β-subenhet10,11 og rekonstituering av α2β2 TS-komplekset fra de isolerte underenhetene12. Rensing ble utført av ammoniumsulfatutfelling, prøvedialyse, DEAE-Sephadex-kromatografi, dialyse og en andre kromatografisk runde på en DEAE-Sephadex kolonne12. I en annen protokoll ble rensingen av det samme komplekset forbedret ved å laste inn det avklarte cellelysatet på en DEAE-Sephadex-kolonne etterfulgt av et kromatografisk trinn på en Sepharose 4B-kolonne, ammoniumsulfatutfelling og dialyse13. Begge renseprotokollene varer i 4-5 dager. Escherichia coli α2β2 TS kompleks krystallisert, men krystaller var ikke egnet for røntgendiffraksjon på den tiden.
I en ny studie ble rekombinante og ville type former for S. typhimurium α2β2 TS-komplekset renset og krystallisert14,15. Det rekombinante α2β2StTS-komplekset ble overekspressert i E. coli-stammen CB149 med pEBA-10-uttrykksvektoren. Innledende krystallisering og røntgendiffraksjonsdatainnsamling og analyse av α2β2StTS-komplekset ble rapportert14. Men lang og tynn nål som α2β2StTS krystaller svekket strukturelle studier. I et forsøk på å samle inn bedre røntgendiffraksjonsdata, ble en annen renselsesprotokoll beskrevet for å rense den ville typen og mutantformene til α2β2StTS-komplekset15. Rensing ble utført med en innledende nedbør ved hjelp av spermin og PEG 8000 i den avklarte cellelysen og et stort klumpete bunnfall ble fjernet ved sentrifugering. Den supernatante fraksjonen som inneholder høye mengder α2β2StTS-komplekset ble lagret i 16-48 timer ved 4 °C til gule krystaller ble utfelt. Krystaller ble vasket og omfattende dialysert mot forskjellige buffere. Proteinkomplekset ble rekrystallisert i buffer som inneholder ammoniumsulfat og dialysert15. Selv om proteinkrystallisering avhenger av protein- og utfellingskonsentrasjoner i oppløsning, er det vanskelig å overvåke, forutsi og reprodusere rensing for andre mutante former for α2β2StTS-kompleks i løsningen. Denne protokollen har fordelen at den ikke bruker noen kromatografiske metoder; Ulempene er imidlertid den lange rensetiden som er nødvendig for å krystallisere, dialyze og rekrystallisere, som vanligvis krever 5-7 dager. For å få krystaller som er egnet for innsamling av røntgendata, mer enn 600 krystalliseringsbetingelser ble evaluert ved hjelp av en kombinasjon og variasjon av proteinkonsentrasjon, temperatur, utfellingsmidler (PEG 4000, 6000 og 8000) og tilsetningsstoffer (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, kadaverin, putrescin, spermin eller spermidin)15. Krystaller hadde en bedre krystallinsk form og vokste raskere under forhold som inneholder 12% PEG 8000 og 2 mM spermin. Krystallisering var gunstigere ved 25 °C i stedet for ved 4, 30 eller 42 °C og vokste til maksimale dimensjoner innen 3 dager15. Flere α2β2StTS krystallstrukturer ble rapportert på den tiden (1996-1999)16,17,18,19,20,21 og mange andre strukturer har blitt publisert til dags dato.
Her er hovedformålet å presentere alternative protokoller for å rense tryptofan syntase og optimalisere proteinkrystallisering. Det nåværende arbeidet viser betydelige forbedringer for å rense den ville typen isolert α-subenhet (αStTS), isolert β-underenhet (βStTS), rekonstituert α2β2StTS-kompleks fra de isolerte underenhetene, og villtype og mutantformer av α2β2StTS-komplekset. Fordelene i forhold til tidligere protokoller er betydelige siden rensetiden ble redusert betydelig og krystallisering og kryobeskyttelse ble optimalisert. Mutante former for α2β2StTS-kompleks konstruert i dette arbeidet har krystallisert nær samme tilstand som brukes til villtypeformen. Imidlertid var fin krystalliseringsoptimalisering nødvendig for å oppnå store enkeltkrystaller av tilstrekkelig kvalitet for strukturbestemmelse ved nær atomoppløsning. Til dags dato er det 134 tryptofan synthase krystallstrukturer deponert i Protein Data Bank (PDB), regnskap 101, 31 og 2 krystallstrukturer, henholdsvis for bakterier, arkaea og eukaryote. Pent tilhører 73 strukturer S. enterica serovar typhimurium og 5 krystallstrukturer av α2β2StTS-komplekset har oppløsningsgrenser høyere enn 1,50 Angstroms. Ikke overraskende ble det utarbeidet 4 av 5 i vår forskningsgruppe (PDB IDs:5CGQ at 1.18 Å, 4HT3 at 1.30 Å, 4HPJ at 1.45 Å, 6DZ4 at 1.45 Å resolution). De raffinerte krystallstrukturene til mutantformen av α2β2StTS-komplekset forventes å gi ny innsikt i mekanismen og rollene som spilles av essensielle aminosyrerester involvert i L-Tryptofan syntese.
Vi har vellykket konstruert mutantform α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, og α2β2 βS377A StTS-komplekser for strukturfunksjonskorrelasjonsstudier. I utgangspunktet har vi forsøkt å rense mutantene ved hjelp av en tidligere renselsesprotokoll22, som krever α2β2StTS kompleks krystallisering med PEG 8000 og spermin under rensing. Selv om krystalliseringshastigheten avhenger av mutantformen og…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health (GM097569).
15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |