PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化
Summary
本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、 大腸菌におけるタンパク質発現、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化である。
Abstract
サルモネラチフィムリウム由来のトリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2 TS)を用いた構造研究が行われ、その触媒機構、アロステリック挙動、およびPLP依存酵素における生成物への酵素的形変換の詳細を理解することが行われている。本研究では、単離されたαおよび単離されたβサブユニットを生成する新規発現系により、2日以内に分離されたサブユニットから2 β st TS複合体をα大量に精製した。精製は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより行い、続いて親和性タグの切断、硫酸アンモニウム沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。β部位の酵素における重要な残基の役割をよりよく理解するために、部位特異的突然変異誘発は、以前の構造研究で行われた。野生型および変異型α 2stTS複合体βを精製する別のプロトコルが作成されました。硫酸アンモニウム分画とSECを用いたシンプルで高速かつ効率的なプロトコルにより、1日で2stTS複合体α 2 β精製が可能になりました。この研究で説明した両方の精製プロトコルは、PEG 8000およびシュペルミンを使用して同じ複合体を精製する前のプロトコルと比較して、精製プロトコルに沿ってα 2 β 2StTS複合体を結晶化する場合にかなりの利点を有する。野生型および変異型の結晶化は、わずかに異なる条件下で生じ、PEG 8000およびスペルミンを用いた一部の変異体の精製を損なう。X線結晶学研究に適した結晶を調製するために、結晶化、結晶質、および凍結保護を最適化するためにいくつかの努力がなされた。ここで提示される方法は、一般に、2st TS複合体のトリプトファン合成酵素サブユニットおよび野生型および変異型α 2 β 2の精製に適用されるべきである。
Introduction
トリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2)は、アクロステリック酵素であり、細菌、植物、および真菌1、2、3におけるアミノ酸L-トリプトファンの生合成における最後の2つのステップを触媒する。サルモネラ菌腸管腸炎セロバル腸管(St)は、ヒトおよび他の動物において重篤な胃腸感染症を引き起こす。ヒトおよび高等動物はTS(EC 4.2.1.20)を有しないため、S.チフィムリウムα 2 β 2 TS複合体(α 2 β 2StTS)の阻害は、クリプトスポリジウム症および結核4、生殖器および眼感染症5の治療のための潜在的な薬物標的として探求されてきた。 αサブユニットは、インドール-3-グリセロールリン酸(IGP)からグリセアルデヒド-3-リン酸(GAP)およびインドールへのアルドー分解切断を触媒し、インドールトタクマー中間体の形成を経て、その後、炭素結合切断を経てGAPとインドール3,6を生成する。β触媒部位には、シッフ塩基を介してβ-Lys87に結合したピリドキサール5′リン酸(PLP)補因子分子が含まれており、これは酵素βサブユニット3,7での反応の過程で電子シンクとして機能する。β部位は、L-トリプトファンおよびPLP依存反応中の水分子を与えるためにインドールによるL-セリン側鎖ヒドロキシルの置換を触媒する。セントTSは、多酵素複合体2,3内における基質チャネリングおよびアロステリック通信の調査のための長年のモデルとして機能する。TSのαとβサブユニット間の双方向のアロステリック通信は、触媒ステップを同期させ、L-トリプトファン合成中のインドール放出を防止するために必要である3。この取り組みを拡張するために、StTS βサブユニットの触媒部位における酵素構造、メカニズムおよび機能の関係をさらに探求するために、単一点突然変異(β-Gln114Ala、β-Lys167Thr、およびβ-Ser377Ala)によっていくつかの変異体を調製しました。
α2β2StTS の触媒機構に関する詳細な研究は、エディス W. マイルズの研究グループによって開始されました。天然大腸菌α 2 β 2TS複合体を用いた初期の研究は、単離されたαサブユニット8、9、単離βサブユニット10、11、およびα 2 β 2TS複合体の分離サブユニット12からの再構成の精製および特徴付けに焦点を当てている。精製は硫酸アンモニウム沈殿、サンプル透析、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、透析、およびDEAE-セファデックスカラム12上の第2のクロマトグラフィーラウンドによって行った。別のプロトコルでは、同じ複合体の精製は、明確化された細胞リセートをDEAE-Sephadexカラムにロードし、続いてセファローズ4Bカラムにクロマトグラフィーステップを行い、硫酸アンモニウム沈殿および透析13を行うことで改善された。両方の精製プロトコルは4〜5日間続きます。エシェリヒア・コリα 2 β 2TS錯体が結晶化したが、当時のX線回折には結晶が適していなかった。
新規研究では、S.チフィムリウムα 2 β 2TS複合体の組換えおよび野生型形態を精製し、14,15を結晶化した。組換えα 2 β 2St TS複合体は、pEBA-10発現ベクターを担持した大腸菌株CB149において過剰発現した。初期結晶化およびX線回折データの収集と分析2stTS複合体β α 2の収集と分析は、14を報告した。しかし、2 β 2StTS結晶αのような長くて細い針は構造研究を損なった。より良いX線回折データを収集する試みにおいて、α 2 β St TS複合体15の野生型および変異型を精製する別の精製プロトコルが記載された。精製は、スペルミンおよびPEG8,000を用いた初期沈殿を用いて精製した細胞リセートに行い、遠心分離により大きなかさばる沈殿物を除去した。高量のα 2 β 2StTS複合体を含む上清画分を、黄色の結晶が析出するまで4°Cで16〜48時間保存した。結晶を洗浄し、異なるバッファーに対して広範囲に透析した。タンパク質複合体は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中で再結晶化し、15.15を透析した。タンパク質の結晶化は、溶液中のタンパク質および沈殿物濃度に依存するが、α 2 β 2StTS複合体の他の変異型の精製を、溶液中で監視、予測、再生することは困難である。このプロトコルには、クロマトグラフィー法を使用しないという利点があります。しかしながら、欠点は、結晶化、透析、再結晶化に必要な長い精製時間であり、典型的には5〜7日を要する。X線データ収集に適した結晶を得るために、600以上の結晶化条件を、タンパク質濃度、温度、沈殿物(PEG4,000、6,000、および8,000)の組み合わせおよび変動を用いて評価した。結晶はより良い結晶形態を持ち、12%PEG 8,000および2 mMのスペルミンを含む条件でより速く成長した。結晶化は4、30、または42°Cではなく25°Cでより好ましく、3日以内に最大寸法15に成長した。当時のα 2 β 2StTS結晶構造(1996-1999)16、17、18、19、20、21、その他多くの構造がこれまでに発表されています。
ここで、主な目的は、トリプトファン合成酵素を精製し、タンパク質の結晶化を最適化するための代替プロトコルを提示することです。本研究は、野生型単離αサブユニット(α St TS)、単離βサブユニット(β St TS)、2 β 2stTS複合体 αを単離されたサブユニットから再構成し、α 2 β 2St TS複合体の野生型および変異型を精製するための有意な改善を示す。 精製時間が大幅に短縮され、結晶化と凍結保護が最適化されるため、過去のプロトコルに対する利点はかなり高いものです。本研究で設計されたα 2 β 2St TS複合体の変異型は、野生型形態に使用される同じ条件付近で結晶化している。しかし、微細結晶化最適化は、原子分解に近いところで構造決定に十分な品質の大きな単結晶を得る必要があった。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した134のトリプトファン合成酵素結晶構造があり、細菌、古細菌および真核生物に関してそれぞれ101、31、2の結晶構造を考慮しています。うまく、73の構造はS.エンテラバーチフィムリウムに属し、α 2 β 2StTS複合体の5つの結晶構造は1.50オングストロームよりも高い解像度制限を有する。当然のことながら、4アウト5は、私たちの研究グループ(PDB ID:5CGQは1.18 Å、4HT3は1.30 Å、4HPJは1.45 Å、6DZ4は1.45 Å解像度で)で作成されました。2stTS複合体α 2 βの変異型の洗練された結晶構造は、L-トリプトファン合成に関与する必須アミノ酸残基が果たすメカニズムおよび役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。
Protocol
Representative Results
Discussion
2 β 2 βの変異型α、α 2 β 2βK167T、α 2 β 2βS377A StTS複合体の構造機能相関研究に成功しました。 当初、我々は、精製中にPEG8000とスペルミンでα 2 β 2StTS複合体結晶化を必要とする以前の精製プロトコル22を用いて変異体を精製しようと試みた。結晶化速度は、変異体の形態および溶液中の複合体の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(GM097569)によって支援されました。
Materials
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
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