वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की कल्पना करने और एचआईवी, एचटीएलवी, एचबीवी, एचसीवी, जीका वायरस और इन्फ्लूएंजा संक्रमण की निगरानी के लिए सिंगल-सेल मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इमेजिंग
Summary
यहां प्रस्तुत एक फ्लोरेसेंस इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एक प्रोटोकॉल है, एमअल्टिप्लेक्स आईएम्यूनोफ्लोरोसेंट सीएल-आधारित डी एटेक्शन ऑफ डीएनए, आरएनए, और पीरोटिन (एमआईसीडीडीआरपी), एक विधि जो विभिन्न प्रकार और स्ट्रैंडनेस के वायरल प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के एक साथ फ्लोरेसेंस सिंगल-सेल विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम है। इस दृष्टिकोण को सिस्टम की एक विविध श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
वायरस की गतिशील प्रतिकृति और असेंबली प्रक्रियाओं को कैप्चर करना मजबूत इन सीटू संकरण (आईएसएच) प्रौद्योगिकियों की कमी से बाधित हुआ है जो वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के संवेदनशील और एक साथ लेबलिंग को सक्षम करते हैं। सीटू संकरण (फिश) विधियों में पारंपरिक डीएनए फ्लोरेसेंस अक्सर इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संगत नहीं होते हैं। इसलिए हमने एक इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किया है, एमआईसीडीडीआरपी (एमअल्टिप्लेक्स आईम्यूनोफ्लोरोसेंट सीएल-आधारित डीएटेक्शन ऑफ डीएनए, आरएनए और पीरोटिन), जो डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के एक साथ एकल-सेल विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। पारंपरिक डीएनए मछली की तुलना में, एमआईसीडीडीआरपी शाखित डीएनए (बीडीएनए) आईएसएच तकनीक का उपयोग करता है, जो नाटकीय रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच संवेदनशीलता और पहचान में सुधार करता है। एमआईसीडीडीआरपी के छोटे संशोधन विभिन्न स्ट्रैंडेडनेस के न्यूक्लिक एसिड (आरएनए या डीएनए) के साथ सहवर्ती वायरल प्रोटीन की इमेजिंग को सक्षम करते हैं। हमने मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी)-1, मानव टी-लिम्फोट्रोपिक वायरस (एचटीएलवी)-1, हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), जीका वायरस (जेडकेवी), और इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) सहित कई वायरल रोगजनकों के जीवन चक्रों का अध्ययन करने के लिए इन प्रोटोकॉल को लागू किया है। हमने प्रदर्शित किया कि हम वायरस की एक विविध श्रृंखला में वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को कुशलतापूर्वक लेबल कर सकते हैं। ये अध्ययन हमें कई वायरल सिस्टम की बेहतर यांत्रिक समझ प्रदान कर सकते हैं, और इसके अलावा, सेलुलर सिस्टम के व्यापक स्पेक्ट्रम में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इमेजिंग के आवेदन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम करते हैं।
Introduction
जबकि पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण के माध्यम से प्रोटीन को विशेष रूप से लेबल करने के लिए हजारों वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, और जबकि संलयन प्रोटीन को एक नमूने1 में कई प्रोटीनों को ट्रैक करने के लिए फोटो-अनुकूलित फ्लोरोसेंट टैग के साथ इंजीनियर किया जा सकता है, प्रोटीन का सूक्ष्म विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर सीटू संकरण (फिश) 2 में पारंपरिक डीएनए प्रतिदीप्ति के साथ संगत नहीं होता है। . प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन में तकनीकी सीमाओं ने वायरस प्रतिकृति की गहन समझ में बाधा डाली है। संक्रमण के दौरान वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन दोनों को ट्रैक करने से वायरोलॉजिस्ट को मौलिक प्रक्रियाओं की कल्पना करने की अनुमति मिलती है जो वायरस प्रतिकृति और असेंबली 3,4,5,6 को कम करते हैं।
हमने एक इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किया है, जो डीएनए, आरएनए और पी रोटिन (एमआईसीडीआरपी) 3 के एम अल्टिप्लेक्स आईएम्यूनोफ्लोरोसेंट सीएल-आधारित डीईटक्शन का उपयोग करता है, जो न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए सीटू तकनीक में शाखित डीएनए (बीडीएनए) का उपयोग करताहै। . इसके अलावा, यह विधि बढ़ी हुई विशिष्टता के लिए युग्मित जांच का उपयोग करती है। बीडीएनए अनुक्रम-विशिष्ट जांच एक तीव्र और स्थानीय संकेत का उत्पादन करने के लिए ब्रांचिंग प्रीएम्पलीफायर और एम्पलीफायर डीएनए का उपयोग करती है, जो पिछले संकरण विधियों पर सुधार करती है जो डीएनए9 में दोहराए गए क्षेत्रों को लक्षित करने पर निर्भर थीं। नैदानिक संदर्भ में संक्रमित कोशिकाओं में अक्सर प्रचुर मात्रा में वायरल आनुवंशिक सामग्री नहीं होती है, जो नैदानिक सेटिंग्स में फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील विधि के लिए एक वस्तु प्रदान करती है। आरएनएस्कोप7 और व्यूआरएनए10 जैसे दृष्टिकोणों के माध्यम से बीडीएनए प्रौद्योगिकी के व्यावसायीकरण ने इस जगह को भर दिया है। बीडीएनए फ्लोरेसेंस इमेजिंग की संवेदनशीलता की सेल बायोलॉजी में भी महत्वपूर्ण उपयोगिता है, जिससे सेल कल्चर मॉडल में दुर्लभ न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों का पता लगाने की अनुमति मिलती है। संवेदनशीलता का विशाल सुधार वायरस का अध्ययन करने के लिए बीडीएनए-आधारित इमेजिंग विधियों को उपयुक्त बनाता है। हालांकि, एक संभावित कमी यह है कि ये विधियां आरएनए या आरएनए और प्रोटीन की कल्पना करने पर ध्यान केंद्रित करती हैं। सभी प्रतिकृति कोशिकाओं और कई वायरस में डीएनए जीनोम होते हैं या उनके प्रतिकृति चक्र के दौरान डीएनए बनाते हैं, जिससे आरएनए और डीएनए, साथ ही प्रोटीन दोनों की इमेजिंग करने में सक्षम तरीके अत्यधिक वांछनीय होते हैं।
एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल में, हम संशोधनों के साथ आरएनएस्कोप विधि का उपयोग करके वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए बीडीएनए फिश करतेहैं। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख संशोधनों में से एक रासायनिक निर्धारण के बाद प्रोटीज उपचार का अनुकूलन है। प्रोटीज उपचार जांच संकरण दक्षता में सुधार के लिए न्यूक्लिक एसिड से बंधे प्रोटीन को हटाने की सुविधा प्रदान करता है। प्रोटीज उपचार के बाद शाखित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच (ओं) के साथ इनक्यूबेशन किया जाता है। बीडीएनए जांच (ओं) के आवेदन के बाद, नमूनों को धोया जाता है और बाद में सिग्नल प्री-एम्पलीफायर और एम्पलीफायर डीएनए के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। मल्टीप्लेक्स इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (आईएसएच), कई जीन लक्ष्यों की लेबलिंग, वर्णक्रमीय भेदभाव के लिए विभिन्न रंग चैनलों के साथ लक्ष्य जांच की आवश्यकता होतीहै। डीएनए एम्पलीफायरों के साथ इनक्यूबेशन के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) होता है।
बीडीएनए आईएसएच लक्ष्य-विशिष्ट संकेतों के प्रवर्धन द्वारा सिग्नल-टू-शोर में सुधार प्रदान करता है, जिसमें गैर-विशिष्ट संकरण घटनाओं से पृष्ठभूमि शोरमें कमी आती है। लक्ष्य जांच को सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर प्रोग्रामों का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया है जो गैर-विशिष्ट संकरण घटनाओं की संभावना की भविष्यवाणी करते हैं, साथ ही जांच-लक्ष्य हाइब्रिड 7,11 के पिघलने तापमान (टीएम) की गणना करते हैं। लक्ष्य जांच में लक्ष्य डीएनए / आरएनए अनुक्रम, एक स्पेसर अनुक्रम और 14-बेस टेल अनुक्रम के पूरक 18- से 25-आधार क्षेत्र होते हैं। लक्ष्य जांच की एक जोड़ी, प्रत्येक एक अलग पूंछ अनुक्रम के साथ, एक लक्ष्य क्षेत्र (~ 50 आधारों तक फैली हुई) में संकरण करती है। दो पूंछ अनुक्रम प्री-एम्पलीफायर जांच के लिए एक संकरण साइट बनाते हैं, जिसमें एम्पलीफायर जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें होती हैं, जिसमें लेबल जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें होती हैं। एक उदाहरण के रूप में, न्यूक्लिक एसिड अणु पर एक किलोबेस (केबी) क्षेत्र को 20 जांच जोड़े द्वारा लक्षित किया जाता है, जिससे प्रीएम्पलीफायर, एम्पलीफायर और लेबल जांच के साथ अनुक्रमिक संकरण के लिए एक आणविक मचान बनता है। इस प्रकार यह प्रति न्यूक्लिक एसिड अणु में 8000 फ्लोरोसेंट लेबल की सैद्धांतिक उपज का कारण बन सकता है, जिससे एकल अणुओं का पता लगाया जा सकता है और पारंपरिक फिश दृष्टिकोण 7 पर विशाल सुधार होसकता है (बीडीएनए सिग्नल प्रवर्धन के योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 ए देखें)। मल्टीप्लेक्स आईएसएच के लिए जांच स्थापित करने के लिए, प्रत्येक लक्ष्य जांच एक अलग रंग चैनल (सी 1, सी 2, या सी 3) में होनी चाहिए। विभिन्न रंग चैनलों के साथ इन लक्ष्य जांचों में अलग-अलग 14-बेस पूंछ अनुक्रम होते हैं। ये पूंछ अनुक्रम अलग-अलग फ्लोरोसेंट जांच के साथ अलग-अलग सिग्नल एम्पलीफायरों को बांधेंगे, इस प्रकार कई लक्ष्यों में आसान वर्णक्रमीय भेदभाव को सक्षम करेंगे। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, चरण 9 में तालिका 4, फ्लोरोसेंटली लेबलिंग लक्ष्य जांच पर अधिक जानकारी प्रदान करता है। इसके अलावा, चित्रा 2 और चित्रा 3 उदाहरण प्रदान करते हैं कि हमने एचआईवी -1 और एचटीएलवी -1 संक्रमणों के बाद कई वायरल न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों के विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एम्पलीफायर 4-एफएल (ए, बी, या सी) (फ्लोरोसेंट जांच और अंतिम संकरण चरण) कैसे चुना।
हमने आरएनए, डीएनए और प्रोटीन के एक साथ प्रतिदीप्ति विज़ुअलाइज़ेशन के कई अनुप्रयोगों का प्रदर्शन किया है, जो उच्च स्थानिक संकल्प 3,4,5 के साथ वायरस प्रतिकृति के महत्वपूर्ण चरणों का अवलोकन करते हैं। उदाहरण के लिए, वायरल आरएनए, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु डीएनए, और प्रोटीन के एक साथ एकल-कोशिका विज़ुअलाइज़ेशन ने हमें एचआईवी -1 संक्रमण के दौरान प्रमुख घटनाओं की कल्पना करने की अनुमति दी है, जिसमें परमाणु प्रवेश से पहले साइटोप्लाज्म में कोर युक्त आरएनए और प्रोवायरल डीएनए3 का एकीकरण शामिल है। इसके अलावा, हमने वायरल संक्रमण और प्रतिकृति 4,5 पर मेजबान कारकों और दवा उपचार के प्रभावों को चिह्नित करने के लिएएमआईसीडीडीआरपी लागू किया है। उका एट अल में, हमने एचआईवी प्रतिलेखन और विलंबता रिवर्सल4 की कल्पना करने के लिए विभिन्न विलंबता-रिवर्सिंग एजेंटों के साथ इलाज किए गए विलंबता सेल मॉडल में एचआईवी -1 प्रतिलेखन के पुनर्सक्रियन को ट्रैक किया। इसके अलावा, एमआईसीडीडीआरपी हमें छोटे अणु उपचार या मेजबान कारक प्रतिबंध के लिए जिम्मेदार एंटीवायरल निषेध से जुड़े फेनोटाइपिक परिवर्तनों की कल्पना करने की अनुमति दे सकता है। हमारे दृष्टिकोण की मजबूती और व्यापक प्रयोज्यता के लिए अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने प्रदर्शित किया है कि हम न केवल मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) -1 में संक्रमण का पालन करने के लिए वायरल न्यूक्लिक एसिड को कुशलतापूर्वक लेबल करने के लिए अपने प्रोटोकॉल के संशोधनों का उपयोग कर सकते हैं, बल्कि मानव टी-लिम्फोट्रोपिक वायरस (एचटीएलवी) -1, हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), जीका वायरस (जेडआईकेवी), और इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी)। चूंकि एचआईवी -1 जीवन चक्र में वायरल डीएनए और आरएनए प्रजातियां दोनों शामिल हैं, इसलिए हमने एचआईवी -1 प्रतिकृति कैनेटीक्स के बाद एमआईसीडीडीआरपी के हमारे अनुकूलन का अधिकांश प्रदर्शन किया है। हालांकि, इसके अलावा, हमने प्रदर्शित किया है कि हम वायरल ट्रांसक्रिप्शन और प्रतिकृति 3,4,5,6 की निगरानी के लिए जेडआईकेवी, आईएवी, एचबीवी और एचसीवी जैसे वायरस में या तो या दोनों सेंस (+) और एंटीसेंस (-) स्ट्रैंडनेस के विभिन्न वायरल आरएनए प्रतिलेख के संश्लेषण को ट्रैक कर सकते हैं। अध्ययन का उद्देश्य कई वायरल प्रक्रियाओं की यंत्रवत समझ में सुधार करना है और सेलुलर मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक को लागू करने के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में काम करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए, डीएनए और प्रोटीन के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अक्सर व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता होती है। दो सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके 5-एथिनाइल-2-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) लेबलिंग और डीएनए फिश हैं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119, और U54 AI150472) द्वारा पूरी तरह से या आंशिक रूप से समर्थित किया गया था। हम इन्फ्लूएंजा ए वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डॉ रेमंड एफ शिनाजी और सैडी अमिचाई को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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