Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe
Summary
Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.
Abstract
La capture des processus dynamiques de réplication et d’assemblage des virus a été entravée par l’absence de technologies robustes d’hybridation in situ (ISH) qui permettent un marquage sensible et simultané des acides nucléiques viraux et des protéines. Les méthodes conventionnelles d’hybridation in situ par fluorescence de l’ADN (FISH) ne sont souvent pas compatibles avec l’immunomarquage. Nous avons donc développé une approche d’imagerie, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA et p rotein), qui permet la visualisation simultanée de l’ADN, de l’ARN et de laprotéine à cellule unique. Par rapport aux poissons à ADN conventionnels, le MICDDRP utilise la technologie ISH de l’ADN ramifié (ADNb), qui améliore considérablement la sensibilité et la détection des sondes oligonucléotidiques. De petites modifications du MICDDRP permettent l’imagerie concomitante de protéines virales avec des acides nucléiques (ARN ou ADN) de différents brins. Nous avons appliqué ces protocoles pour étudier les cycles de vie de plusieurs agents pathogènes viraux, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1, le virus T-lymphotrope humain (HTLV)-1, le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC), le virus Zika (ZKV) et le virus de la grippe A (IAV). Nous avons démontré que nous pouvons marquer efficacement les acides nucléiques et les protéines virales dans un large éventail de virus. Ces études peuvent nous fournir une meilleure compréhension mécaniste de plusieurs systèmes viraux et, en outre, servir de modèle pour l’application de l’imagerie par fluorescence multiplexée de l’ADN, de l’ARN et des protéines à travers un large spectre de systèmes cellulaires.
Introduction
Alors que des milliers d’anticorps commerciaux sont disponibles pour marquer spécifiquement les protéines via des approches d’immunomarquage conventionnelles, et bien que les protéines de fusion puissent être conçues avec des marqueurs fluorescents photo-optimisés pour suivre plusieurs protéines dans un échantillon1, la visualisation microscopique des protéines n’est souvent pas compatible avec l’hybridation in situ par fluorescence d’ADN conventionnelle (FISH)2 . Les limites techniques de la visualisation simultanée de l’ADN, de l’ARN et des protéines à l’aide d’approches basées sur la fluorescence ont entravé la compréhension approfondie de la réplication virale. Le suivi des acides nucléiques viraux et des protéines au cours de l’infection permet aux virologues de visualiser les processus fondamentaux qui sous-tendent la réplication et l’assemblagedu virus 3,4,5,6.
Nous avons développé une approche d’imagerie, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA et Protein (MICDDRP)3, qui utilise la technologie in situ de l’ADN ramifié (ADNb) pour améliorer la sensibilité de la détection des acides nucléiques 7,8,9 . De plus, cette méthode utilise des sondes appariées pour une spécificité accrue. Les sondes spécifiques à la séquence d’ADNb utilisent des ADN de préamplificateur et d’amplificateur ramifiés pour produire un signal intense et localisé, améliorant ainsi les méthodes d’hybridation précédentes qui reposaient sur le ciblage de régions répétées dans l’ADN9. Les cellules infectées dans un contexte clinique ne contiennent souvent pas de matériel génétique viral abondant, ce qui constitue un produit de base pour une méthode sensible de détection des acides nucléiques fluorescents dans des contextes de diagnostic. La commercialisation de la technologie de l’ADNb par le biais d’approches telles queRNAscope 7 et ViewRNA10 a comblé ce créneau. La sensibilité de l’imagerie par fluorescence de l’ADNb a également une utilité importante en biologie cellulaire, permettant la détection d’espèces d’acides nucléiques rares dans les modèles de culture cellulaire. La grande amélioration de la sensibilité rend les méthodes d’imagerie basées sur l’ADNb appropriées pour étudier les virus. Une lacune potentielle, cependant, est que ces méthodes se concentrent sur la visualisation de l’ARN ou de l’ARN et des protéines. Toutes les cellules réplicatives et de nombreux virus ont des génomes d’ADN ou forment de l’ADN au cours de leur cycle de réplication, ce qui rend les méthodes capables d’imager à la fois l’ARN et l’ADN, ainsi que les protéines, hautement souhaitables.
Dans le protocole MICDDRP, nous effectuons bDNA FISH pour la détection de l’acide nucléique viral à l’aide de la méthode RNAscope, avec des modifications7. L’une des modifications majeures apportées à ce protocole est l’optimisation du traitement de la protéase après fixation chimique. Le traitement à la protéase facilite l’élimination des protéines liées à l’acide nucléique pour améliorer l’efficacité de l’hybridation de la sonde. Le traitement à la protéase est suivi d’une incubation avec une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques ramifiées. Après l’application de sondes d’ADNb, les échantillons sont lavés puis incubés avec des ADN de préamplificateur de signal et d’amplificateur. L’hybridation in situ multiplexée (ISH), le marquage de cibles génétiques multiples, nécessite des sondes cibles avec différents canaux de couleur pour la différenciation spectrale7. L’incubation avec des amplificateurs d’ADN est suivie d’une immunofluorescence (IF).
bDNA ISH apporte des améliorations du rapport signal-bruit par amplification de signaux spécifiques à la cible, avec une réduction du bruit de fond provenant d’événements d’hybridation non spécifiques 7,11. Les sondes cibles sont conçues à l’aide de logiciels accessibles au public qui prédisent la probabilité d’événements d’hybridation non spécifiques, ainsi que la température de fusion (Tm) de l’hybride sonde-cible 7,11. Les sondes cibles contiennent une région de 18 à 25 bases complémentaire à la séquence ADN/ARN cible, une séquence d’espacement et une séquence de queue de 14 bases. Une paire de sondes cibles, chacune avec une séquence de queue distincte, s’hybrident à une région cible (couvrant ~50 bases). Les deux séquences de queue forment un site d’hybridation pour les sondes préamplificateurs, qui contiennent 20 sites de liaison pour les sondes amplificateurs, qui contiennent en plus 20 sites de liaison pour la sonde d’étiquette. Par exemple, une région d’une kilobase (kb) sur la molécule d’acide nucléique est ciblée par 20 paires de sondes, créant un échafaudage moléculaire pour l’hybridation séquentielle avec le préamplificateur, l’amplificateur et la sonde de marque. Cela peut donc conduire à un rendement théorique de 8000 marqueurs fluorescents par molécule d’acide nucléique, permettant la détection de molécules uniques et de vastes améliorations par rapport aux approches FISHconventionnelles 7 (voir Figure 1A pour le schéma de l’amplification du signal de l’ADNb). Pour configurer des sondes pour des ISH multiplexés, chaque sonde cible doit se trouver dans un canal de couleur différent (C1, C2 ou C3). Ces sondes cibles avec des canaux de couleur différents possèdent des séquences de queue distinctes à 14 bases. Ces séquences de queue lieront des amplificateurs de signaux distincts avec différentes sondes fluorescentes, permettant ainsi une différenciation spectrale facile sur plusieurs cibles. Dans le Protocole présenté, le tableau 4 de l’étape 9 fournit des informations supplémentaires sur le marquage fluorescent des sondes cibles. De plus, la figure 2 et la figure 3 fournissent des exemples de la façon dont nous avons choisi l’amplificateur 4-FL (A, B ou C) approprié (sonde fluorescente et étape finale d’hybridation) pour obtenir un marquage fluorescent spécifique de plusieurs cibles d’acides nucléiques viraux après des infections par le VIH-1 et le HTLV-1.
Nous avons démontré plusieurs applications de visualisation simultanée par fluorescence de l’ARN, de l’ADN et des protéines, en observant les étapes critiques de la réplication du virus avec une résolution spatio-temporelle élevée 3,4,5. Par exemple, la visualisation simultanée à cellule unique de l’ARN viral, de l’ADN cytoplasmique et nucléaire et des protéines nous a permis de visualiser les événements clés de l’infection par le VIH-1, y compris le suivi des noyaux contenant de l’ARN dans le cytoplasme avant l’entrée nucléaire et l’intégration de l’ADN proviral3. De plus, nous avons appliqué le MICDDRP pour caractériser les effets des facteurs de l’hôte et du traitement médicamenteux sur l’infection virale et la réplication 4,5. Dans Ukah et al., nous avons suivi la réactivation de la transcription du VIH-1 dans des modèles de cellules de latence traités avec différents agents d’inversion de latence pour visualiser la transcription du VIH et l’inversion de la latence4. De plus, le MICDDRP peut nous permettre de visualiser les changements phénotypiques associés à l’inhibition antivirale attribuée au traitement à petites molécules ou à la restriction du facteur hôte. Comme preuve de concept de la robustesse et de la large applicabilité de notre approche, nous avons démontré que nous pouvons utiliser des modifications de notre protocole pour marquer efficacement l’acide nucléique viral afin de suivre l’infection non seulement dans le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1, mais aussi dans le virus T-lymphotrope humain (HTLV)-1, le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC), virus Zika (ZIKV) et virus de la grippe A (IAV). Comme le cycle de vie du VIH-1 se compose à la fois d’ADN viral et d’espèces d’ARN, nous avons effectué la majorité de notre optimisation du MICDDRP après la cinétique de réplication du VIH-1. Cependant, en outre, nous avons démontré que nous pouvons suivre la synthèse de différents transcrits d’ARN viral de l’un ou l’autre ou des deux sens (+) et antisens (-) chez des virus tels que ZIKV, IAV, HBV et HCV pour surveiller la transcription virale et la réplication 3,4,5,6. Les études visent à améliorer la compréhension mécaniste de plusieurs processus viraux et servent de lignes directrices pour mettre en œuvre cette technologie d’imagerie par fluorescence dans un large éventail de modèles cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualisation simultanée de l’ARN, de l’ADN et des protéines nécessite souvent une optimisation approfondie. Deux méthodes couramment utilisées sont le marquage de la 5-éthynyl-2-désoxyuridine (EdU) et l’ADN FISH. Le marquage EdU a été appliqué pour visualiser simultanément l’ADN viral et les protéines, car EdU est incorporé dans l’ADN naissant et ensuite marqué avec des colorants fluorescents contenant de l’azoture via la chimie du clic. Le marquage EdU peut ainsi être utilisé pou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en tout ou en partie par les National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 et U54 AI150472). Nous remercions le Dr Raymond F. Schinazi et Sadie Amichai d’avoir fourni des cellules infectées par le virus de la grippe A.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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