一過性両側性頸動脈閉塞による虚血性筋炎損傷のマウスモデル
Summary
ここでは、単純な縫合糸とクランプを用いた一過性両側共通頸動脈閉塞によるレチナル虚血のマウスモデルについて述べている。このモデルは、心血管異常によって引き起こされる虚血の病的メカニズムを理解するのに有用である。
Abstract
糖尿病性網膜症、網膜静脈または動脈の閉塞、眼性虚血症候群などの多様な血管疾患は、網膜虚血を引き起こす可能性があります。レチナル虚血の病理的メカニズムを調べるには、関連する実験モデルを開発する必要がある。解剖学的に、主な眼の血液供給血管は眼動脈(OpA)であり、OpAは一般的な頸動脈(CCA)の内頚動脈に由来する。したがって、CCAの破壊は効果的に、虚血の原因となりうる。ここでは、一過性両側性一般的な頸動脈閉塞(tBCCAO)によるレチナル虚血のマウスモデルを確立し、右CCAを6-0シルク縫合糸で結び付け、クランプを介して左CCAを一時的に2秒間閉塞させ、tBCCAOが急性レチナル虚血を誘発し、性間機能障害を引き起こす可能性があることを示した。現在の方法は、手術針とクランプのみを使用することによって手術器具への依存を減らし、中大脳動脈閉塞のマウスモデルによく見られる予期せぬ動物の死を最小限に抑えるために閉塞時間を短縮し、一般的な再発性虚血所見の再現性を維持する。このモデルは、マウスにおける虚血性網膜症の病態生理を調べるのに利用でき、さらにインビボ薬物スクリーニングに使用することができる。
Introduction
このレティナは、視覚機能のための神経感覚組織である。視覚機能には相当量の酸素が必要であるため、このレティナは体内で最も酸素要求の多い組織の1つとして知られている。このレティナは、酸素が血管を介して送達される血管疾患の影響を受けやすい。糖尿病性網膜症や網膜血管(静脈または動脈)閉塞などの血管疾患の様々なタイプは、網膜虚血を誘発することができます。レチナル虚血の病理的メカニズムを調べるには、再現性と臨床的に関連する、レチナル虚血の実験モデルが必要と考えられる。中大脳動脈閉塞(MCAO)は、インビボ歯止め薬の実験用虚血2,3の開発に最も一般的に利用される方法である内無血フィラメントの挿入による。MCAに対する眼動脈(OpA)の近接性のために、MCAOモデルは、網膜虚血4、5、6の病態生理を理解するために同時に使用される。脳虚血を、レチナル虚血と共に誘導するために、長いフィラメントは通常、一般的な頸動脈(CCA)または外頸動脈(ECA)の切開を通して挿入される。これらの方法は、実行するのが困難であり、手術を完了するのに長い時間(1つのマウスで60分以上)を必要とし、手術後の結果に高い変動性をもたらす7。これらの懸念を改善するために、より良いモデルを開発することが依然として重要です。
本研究では、短い一過性の両側CCA閉塞(tBCCAO)を針とクランプで使用してマウスの裂精虚血を誘導し、陰部における虚血性傷害の典型的な結果を分析した。このビデオでは、tBCCAO の手順のデモンストレーションを行います。
Protocol
ここに記載されている方法はすべて、慶應義塾大学医学部のIACUC(IACUC)の教育機関で承認されています。 1. 手術器具・動物の準備 オートクレーブ手術器具を70%エチルアルコールに保ちます。新しい外科手術の前に、70%のエチルアルコールを使用して慎重に外科用器具を洗浄する。 雄BALB/cAJc1マウス(生後6週、26~28kg)を、手術前、手術中、手術後の無菌状態を?…
Representative Results
2分間のFITC-dextranの全身循環後、恥動マウスおよびtBCCAO操作マウスにおける左右のレチナの眼管切開を調べた(補足図1)。FITC-dextranは、tBCCAO操作マウスのシャム操作マウスと左レチナの両方で完全に見えるが、tBCCAO操作マウスの右左部内で部分的に検出可能であった。 tBCCAOの後、眼瞼垂れを調べた(図2)。右目は軽度(スコア2;75%)を示したと?…
Discussion
この研究では、単純な縫合糸とクランプを使用したtBCCAOが、眼科虚血およびそれに伴う筋機能障害を引き起こす可能性があることを示している。さらに、我々は、レチナル虚血のマウスモデルの開発のための我々の現在のプロトコルは、2、3、7の陰部虚血損傷モデルの開発のための他の以前のプロトコルと比較してより簡…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、文部科学省(MEXT)から科学研究助成(KAKENHI)(18K09424から栗原敏秀、20K18393から三輪幸宏)の支援を受けた。
Materials
| Atipamezole hydrochloride | Zenoaq | Antisedan | For anti-anesthesia |
| Applied Biosystems 7500 Fast | Applied Biosystems | – | For qPCR |
| Butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | For anesthesia |
| BZ-II Analyzer | KEYENCE | – | For an image merge |
| BALB/cAJc1 | CLEA | – | Mouse strain |
| β-Actin (8H10D10) Mouse mAb | CST | 3700 | For western blot |
| Clamp Forcep | World Precision Instruments | WPI 500451 | For surgery |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | For surgery |
| DAPI solution | Dojindo | 340-07971 | For IHC |
| Envisu SD-OCT system | Leica | R4310 | For OCT |
| FITC-dextran | Merk | FD2000S | For retinal blood perfusion |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | For fluorescence detection |
| Gatifloxacin hydrate | Senju Pharmaceutical | Gachifuro | For anti-bacterial infection |
| GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) | Thermo | 13-0300 | For IHC |
| Heating pad | Marukan | RH-200 | For surgery |
| HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb | CST | 36169 | For western blot |
| ImageQuant LAS 4000 mini | GE Healthcare | – | For chemiluminescence |
| Midazolam | Sandoz K.K | SANDOZ | For anesthesia |
| Microtome Tissue-Tek TEC 6 | Sakura | – | For sectioning |
| Medetomidine | Orion Corporation | Domitor | For anesthesia |
| Needle holder | Handaya | HS-2307 | For surgery |
| PuREC | MAYO Corporation | – | For ERG |
| Scissor | Fine Science Tools | 91460-11 | For surgery |
| Sodium hyaluronate | Santen Pharmaceutical | Hyalein | For eye lubrication |
| Tropicamide/Penylephrine hydrochloride | Santen Pharmaceutical | Mydrin-P | For mydriasis |
| 6-0 silk suture | Natsume | E12-60N2 | For surgery |
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Cite This Article
Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).