JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

Published: May 28, 2021
doi:
10.3791/61870
, , ,
1Huffington Center on Aging,Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute,Baylor College of Medicine

Summary

Микроскопия с стимулированным рамановской рассеянием (SRS) позволяет селективно, без маркировки визуализировать конкретные химические части и эффективно используется для изображения липидных молекул in vivo. Здесь мы предоставляем краткое введение в принцип SRS-микроскопии и описываем методы его использования в визуализации хранения липидов у Caenorhabditis elegans.

Abstract

Липидный обмен является фундаментальным физиологическим процессом, необходимым для здоровья клеток и организма. Нарушение регуляции липидного обмена часто вызывает ожирение и многие связанные с ним заболевания, включая сердечно-сосудистые расстройства, диабет II типа и рак. Чтобы продвинуть современное понимание липидной метаболической регуляции, количественные методы точного измерения уровней хранения липидов in vivo во времени и пространстве становятся все более важными и полезными. Традиционные подходы к анализу накопления липидов являются полукоципными для микроскопической оценки или не имеют пространственно-временной информации для биохимического измерения. Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) представляет собой технологию химической визуализации без меток, которая позволяет быстро и количественно обнаруживать липиды в живых клетках с субклеточным разрешением. Поскольку контраст используется от внутренних молекулярных колебаний, микроскопия SRS также позволяет четырехмерное отслеживание липидов у живых животных. В последнее десятилетие микроскопия SRS широко используется для визуализации малых молекул в биомедицинских исследованиях и преодолевает основные ограничения обычных методов флуоресцентного окрашивания и экстракции липидов. В лаборатории мы объединили микроскопию SRS с генетическими и биохимическими инструментами, доступными мощному модельному организму Caenorhabditis elegans, чтобы исследовать распределение и неоднородность липидных капель в разных клетках и тканях и, в конечном счете, обнаружить новые сохраненные сигнальные пути, которые модулируют метаболизм липидов. Здесь мы представляем принципы работы и подробную настройку микроскопа SRS и предоставляем методы его использования для количественной оценки накопления липидов в различных временных точках развития мутанта C. elegans дикого типа и инсулина, сигнализирующих с дефицитом мутанта C. elegans.

Introduction

Ожирение стало глобальной проблемой здравоохранения, угрожающей одной трети населения во всем мире, и оно представляет собой серьезную медицинскую проблему, учитывая его связь с плохим психическим здоровьем1 и смертельными заболеваниями, включая диабет2,сердечно-сосудистые заболевания3 и некоторые виды рака4. Изучение липидного обмена имеет важное значение для лучшего понимания биологических проблем, стоящих за ожирением. Быстрая и специфическая количественная оценка накопления липидов влечет за собой обнаружение жирных кислот и их производных, а также стеролсодержащих метаболитов, с высокой чувствительностью и предпочтительно с пространственной информацией. Липиды являются сложными целями для изображения, потому что им не хватает внутренней флуоресценции и их нельзя легко пометить флуоресцентно. Флуоресцентные метки часто больше, чем молекулы липидов, и, следовательно, могут быть химически инвазивными и непрактичными для применения in vivo. Стратегия маркировки без меток или минимальная необходима для сохранения гидрофобной структуры липидных молекул5. Последние разработки в области технологий визуализации создали захватывающие возможности для визуализации липидов без маркировки в живых клетках, тканях и организмах.

Традиционные подходы к анализу хранения липидов в биологических образцах включают биохимические анализы и протоколы окрашивания липофильными красителями. Биохимические количественные анализы, включающие масс-спектрометрию (МС), не имеют себе равных по своей молекулярной рассасывляемости, но они требуют очень больших количеств образцов, и подготовка образцов обычно занимает несколько часов, ограничивая их применение для визуализации живых систем в режиме реальноговремени 5. Другим серьезным ограничением этих анализов является отсутствие пространственной информации. С другой стороны, липофильные красители, такие как Oil Red O и Sudan Black, обеспечивают тканевое и клеточное распределение органелл хранения липидов, и по сравнению с методами MS, эти методы окрашивания также являются недорогими и простыми в выполнении. Однако эти протоколы окрашивания требуют фиксации, которая может повлиять на гидрофобную природу липидных капель, вызвать искусственные изменения в их структуре и привести к несоответствиям между экспериментами6. Технические трудности, связанные с биохимическими методами и методами окрашивания, привели к поиску безмеклеточных методов для изображения липидных молекул и к быстрому увеличению использования когерентной рамановской рассеянной (CRS) микроскопии в липидной визуализации.

Эффект Рамана был впервые признан Раманом и Кришнаном, где они сообщили, что при взаимодействии с фотоном молекула может генерировать рассеянный свет без изменения длины волны (так называемое рэлеевское рассеяние) или редко с измененной длиной волны (называемой рамановским рассеянием), и это изменение длины волны характерно для функциональных химических групп внутри молекулы7. Когда химические связи внутри молекулы возбуждаются до более высокого вибрационного энергетического уровня падежаящим фотоном, называемым фотоном насоса, энергия рассеянного фотона, называемого фотоном Стокса, становится ниже. В противном случае химические связи могут достичь более низкого уровня вибрационной энергии, если они изначально находятся на более высоком уровне, а рассеянный фотон получает энергию, чтобы быть фотоном против Стокса. Разница частот между падающе и рассеянными фотонами известна как рамановский сдвиг. Каждая химическая связь внутри молекулы имеет характерный и поддающиеся количественной оценке рамановский сдвиг. Например, связь CH2 имеет рамановский сдвиг 2,845 см-1,который в изобилии присутствует в цепях жирных кислот8. Этот спонтанный рамановский сигнал, как правило, очень слаб, что значительно ограничивает скорость визуализации в обычной спонтанной рамановской микроскопии. На протяжении многих лет были разработаны различные подходы для повышения скорости изображения и чувствительности спонтанной рамановской микроскопии. Когерентная комбинационные рассеянные микроскопии, включая когерентную рамановское рассеяние против Стокса (CARS) и микроскопию стимулированного рамановского рассеяния (SRS), является самым последним прогрессом. CARS и SRS имеют несколько разные принципы работы, но оба являются методами без меток, которые имеют возможность визуализации в реальном времени, могут давать пространственную и временную информацию о динамике хранения липидов и требуют только небольшого размера выборки. Микроскопия CARS страдает от нереконсервного фона, который исходит от различных нелинейных процессов, а сигналы CARS также имеют нелинейную связь с концентрацией молекулы, что в совокупности усложняет процесс количественной оценки9. В отличие от микроскопии CARS, микроскопия SRS не генерирует невозвествующих фоновых сигналов и предлагает линейную зависимость от концентрации интересуемой молекулы. Таким образом, в настоящее время микроскопия SRS более широко используется для липидной визуализации.

В микроскопии SRS слабые спонтанные рамановские сигналы могут быть усилены при возбуждении двумя синхронизированными лазерными лучами, причем их разность частот соответствует частоте колебаний химической связи. Молекула будет испытывать усиленный переход в возбужденное состояние за счет когерентного возбуждения. В результате скорость генерации фотонов Стокса увеличивается. Следовательно, интенсивность передаваемого «стоксового» пучка увеличивается (стимулируется рамановский усиление, SRG) и уменьшается интенсивность передаваемого «насосного» пучка (стимулируются рамановские потери, SRL). Обнаружение сигналов SRG или SRL лежит в основе микроскопии стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) микроскопии молекул со специфическими химическими связями10. Если разность частот между двумя лазерными лучами не соответствует колебательной частоте химической связи внутри интересующей молекулы, то ни SRG, ни SRL сигналы не будут генерироваться. Скорость визуализации SRS-микроскопии составляет около 2 мксек на пиксель или 1 секунду на кадр, что намного быстрее, чем спонтанная рамановская микроскопия11. Типичное боковое разрешение для SRS-микроскопии ограничено дифракцией и составляет около 300 нм. Кроме того, двухфотонные оптические процессы SRS-микроскопии позволяют проводить объемную 3D-визуализацию относительно толстых образцов тканей, а глубина изображения может достигать 300–500 мкм. В целом, микроскопия SRS представляет собой эффективный, без маркировки метод визуализации для обнаружения конкретных биомолекул, особенно липидов.

Липидные капли представляют собой одномембранные органеллы, которые являются основным клеточным местом хранения нейтральных липидов, включая триацилглицеролы (TAGs) и сложные эфиры холестерина (CEs). Связи CH2 в цепях жирных кислот этих липидных молекул генерируют сильные сигналы SRS при 2,845см-1 при возбуждении8,что позволяет обнаруживать и количественно определять уровни хранения липидов в интактных клетках, участках тканей и даже целых организмах12,13,14,15. В частности, C. elegans полезны для исследований липидной визуализации благодаря своей прозрачности. Как и млекопитающие, C. elegans также хранят липиды в липидных каплях, а пути синтеза и деградации молекул липидов высоко сохраняются16. В этом протоколе мы предоставим принцип работы SRS-микроскопии, ее фундаментальную настройку и опишем методы ее использования в липидной визуализации у C. elegans.

Protocol

1. Инструментальная установка для стимулированной рамановой рассеянной микроскопии ПРИМЕЧАНИЕ: Система микроскопии SRS построена на пикосекундном лазере со встроенным оптическим параметрическим осциллятором и конфокальным лазерным сканируемым микроскопом. Генератор о…

Representative Results

Передача сигналов инсулина является важным эндокринным путем, который влияет на развитие, размножение, продолжительность жизни и метаболизм. У червей передача сигналов инсулина состоит из около 40 инсулиноподобных пептидных лигандов, инсулиноподобного рецептора фактора роста ортоло?…

Discussion

В защиту от ожирения и связанных с ним метаболических нарушений были предприняты важные исследовательские усилия для лучшего понимания регуляторных механизмов липидного гомеостаза. Для количественного обнаружения молекул липидов в биологических образцах было доказано, что визуали?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) и исследователем HHMI (M.C.W.). Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis (CGC) за штаммы C. elegans.

Materials

A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool – adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool – target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool – tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		 For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. 유전학. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. 유전학. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Tags

Stimulated Raman Scattering MicroscopyLabel-free ImagingLipid StorageCaenorhabditis ElegansLaser AlignmentBeam ExpanderRelay MirrorsPeriscopePower MeterObjective AlignmentFluorescence Target Alignment Cap

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image