הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה
Summary
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה סלקטיבית ונטולת תווית של moieties כימיים ספציפיים והיא שימשה ביעילות כדי לדמות מולקולות השומנים ב vivo. כאן, אנו מספקים היכרות קצרה עם העיקרון של מיקרוסקופיה SRS ומתארים שיטות לשימוש בו באחסון השומנים הדמיה ב Caenorhabditis elegans.
Abstract
חילוף החומרים של השומנים הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי הנחוץ לבריאות התאים והאורגניזמים. Dysregulation של חילוף החומרים של השומנים לעתים קרובות מעורר השמנת יתר ומחלות רבות הקשורות כולל הפרעות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, וסרטן. כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של ויסות מטבולי השומנים, שיטות כמותיות כדי למדוד במדויק את רמות אחסון השומנים vivo בזמן ובמרחב הפכו חשובים ושימושיים יותר ויותר. הגישות המסורתיות לניתוח אחסון שומנים הן כמותיות למחצה להערכה מיקרוסקופית או חסר מידע מרחבי-זמני למדידה ביוכימית. מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכנולוגיית הדמיה כימית נטולת תוויות המאפשרת זיהוי מהיר וכמותי של שומנים בתאים חיים ברזולוציה תת-תאית. מכיוון שהניגוד מנוצל מתנודות מולקולריות מהותיות, מיקרוסקופיה SRS מאפשרת גם מעקב ארבע מימדי אחר שומנים בבעלי חיים. בעשור האחרון, מיקרוסקופיה SRS כבר בשימוש נרחב עבור הדמיה מולקולה קטנה במחקר ביו ולהתגבר על המגבלות העיקריות של כתמים פלואורסצנטיים קונבנציונליים ושיטות מיצוי השומנים. במעבדה, שילבנו מיקרוסקופיה SRS עם הכלים הגנטיים והביוכימיים הזמינים לאורגניזם המודל החזק, Caenorhabditis elegans, כדי לחקור את ההפצה וההטרוגניות של טיפות השומנים על פני תאים ורקמות שונים ובסופו של דבר לגלות מסלולי איתות שמורים חדשניים המווסתים את חילוף החומרים של השומנים. כאן, אנו מציגים את עקרונות העבודה ואת ההתקנה המפורטת של מיקרוסקופ SRS ולספק שיטות לשימוש בו לכימות אחסון השומנים בנקודות זמן התפתחותיות מובהקות של סוג פראי ואינסולין איתות מוטציה לקוי C. elegans.
Introduction
השמנת יתר הפכה לבעיה בריאותית עולמית המאיימת על שליש מהאוכלוסייה ברחבי העולם, והיא מציגה דאגה רפואית חמורה, בהתחשב בקשר שלה עם בריאות נפשיתירודה 1 ומחלות קטלניות כולל סוכרת2, מחלות לב וכלידם 3 וסוגים מסוימים של סרטן4. מחקר של חילוף החומרים של השומנים חיוני כדי להבין טוב יותר את הבעיות הביולוגיות מאחורי השמנת יתר. כימות מהיר וספציפי של אחסון השומנים כרוך בזיהוי חומצות שומן ונגזרותיהן, כמו גם מטבוליטים המכילים סטרול, עם רגישות גבוהה ועדיף עם מידע מרחבי. שומנים הם מטרות מאתגרות לתמונה כי הם חסרים פלואורסצנטיות מהותית ולא ניתן לתייג בקלות פלואורסצנטית. תגי הפלואורסצנט הם לעתים קרובות גדולים יותר מאשר מולקולות השומנים, ולכן, יכול להיות פולשני מבחינה כימית ולא מעשי עבור יישומי vivo. אסטרטגיית תיוג ללא תווית או מינימלית נחוצה כדי לשמר את המבנה ההידרופובי של מולקולות השומנים5. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות הדמיה יצרו הזדמנויות מרגשות להדמיה נטולת תוויות של שומנים בתאים חיים, רקמות ואורגניזמים.
גישות מסורתיות לניתוחי אחסון שומנים בדגימות ביולוגיות כוללות מבחנים ביוכימיים ופרוטוקולי כתמים עם צבעים ליפופיליים. מבחני כימות ביוכימי מעורבים ספקטרומטריית מסה (MS) הם ללא תחרות בפתרון מולקולרי שלהם, אבל הם דורשים כמויות מדגם גדולות מאוד הכנה מדגם בדרך כלל לוקח כמה שעות, הגבלת היישום שלהם עבור הדמיה בזמן אמת של מערכותחיים 5. מגבלה מרכזית נוספת של מבחנים אלה היא היעדר מידע מרחבי. מצד שני, צבעים ליפופיליים כגון שמן אדום O סודן שחור לספק רקמות והפצה הסלולר של organelles אחסון השומנים לעומת טכניקות טרשת נפוצה, שיטות כתמים אלה הם גם בעלות נמוכה וקל לבצע. עם זאת, פרוטוקולי הכתמה אלה דורשים קיבעון, אשר יכול להשפיע על האופי ההידרופובי של טיפות השומנים, ליצור שינויים מלאכותיים במבנה שלהם לגרום חוסר עקביות בין ניסויים6. הקשיים הטכניים הקשורים לטכניקות ביוכימיות וכתמים הובילו לחיפוש שיטות נטולות תוויות לדימוי מולקולות שומנים ולעלייה המהירה בשימוש במיקרוסקופיה קוהרנטית של פיזור ראמאן (CRS) בהדמיית שומנים.
אפקט ראמאן הוכר לראשונה על ידי ראמאן וקרישנן, שם דיווחו כי באינטראקציה עם פוטון, מולקולה יכולה ליצור אור מפוזר ללא שינוי באורך הגל (הנקרא פיזור ריילי) או לעתים רחוקות עם אורך גל שונה (הנקרא פיזור ראמאן) ושינוי זה באורך הגל אופייני לקבוצות הכימיות הפונקציונליות בתוך המולקולה7. כאשר הקשרים הכימיים בתוך מולקולה מתרגשים לרמת אנרגיה רטט גבוהה יותר על ידי אירוע פוטון, הנקרא משאבת פוטון, האנרגיה של פוטון מפוזר, הנקרא פוטון סטוקס, להיות נמוך יותר. אחרת, הקשרים הכימיים יכולים להגיע לרמת אנרגיה רטט נמוכה יותר אם הם במקור ברמה גבוהה יותר, והפוטון המפוזר צובר אנרגיה כדי להיות פוטון אנטי סטוקס. הבדל התדרים בין האירוע לבין פוטונים מפוזרים ידוע בשם משמרת ראמאן. לכל קשר כימי בתוך מולקולה יש שינוי ראמאן אופייני וניתן לכימות. לדוגמה, אג”ח CH2 יש משמרת ראמאן של 2,845 ס”מ-1, אשר שופע שרשראות חומצות שומן8. אות ראמאן ספונטני זה הוא בדרך כלל חלש מאוד, אשר הגביל במידה ניכרת את מהירות ההדמיה במיקרוסקופיה ראמאן ספונטנית קונבנציונלית. במהלך השנים פותחו גישות שונות להגברת מהירות ההדמיה והרגישות של מיקרוסקופיה ראמאן ספונטנית. מיקרוסקופיית פיזור ראמאן קוהרנטית, כולל מיקרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן פיזור (CARS) ומיקרוסקופיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS), היא ההתקדמות האחרונה. למכוניות ול-SRS יש עקרונות עבודה שונים במקצת, אך שתיהן טכניקות נטולות תוויות בעלות יכולת הדמיה חיה, יכולות להניב מידע מרחבי וטמפורלי על דינמיקת אחסון השומנים, ודורשות רק גודל דגימה קטן. מיקרוסקופיה של CARS סובלת מרקע לא מהדהד, שמקורו בתהליכים לא ליניאריים שונים, ולאותות CARS יש גם קשר לא ליניארי עם ריכוז המולקולה, אשר יחד מסבכים את תהליך הכימות9. שלא כמו מיקרוסקופיה של CARS, מיקרוסקופיה SRS אינה מייצרת אותות רקע שאינם מהדהדים ומציעה תלות ליניארית בריכוז המולקולה המעניינת. לכן, כיום מיקרוסקופיה SRS נעשה שימוש נרחב יותר עבור הדמיית שומנים.
במיקרוסקופיה SRS, אותות ראמאן ספונטני חלש ניתן להגביר כאשר נרגש על ידי שתי קרני לייזר מסונכרנות עם הפרש התדרים שלהם התאמת תדר רטט הקשר הכימי. המולקולה תחווה מעבר משופר למצב נרגש עקב עירור קוהרנטי. כתוצאה מכך, קצב ייצור הפוטונים של סטוקס מוגבר. כתוצאה מכך, עוצמת קרן “סטוקס” המשודרת עולה (מגורה רווח ראמאן, SRG) ואת עוצמת הקרן “משאבה” מועבר פוחתת (מגורה אובדן ראמאן, SRL). זיהוי אותות SRG או SRL עומד בבסיס הדמיית מיקרוסקופיה של מיקרוסקופיה של מולקולות עם קשרים כימיים ספציפיים10. אם הפרש התדרים בין שתי קרני הלייזר אינו תואם לתדר הרטט של הקשר הכימי בתוך מולקולה בעלת עניין, לא ייווצרו אותות SRG ולא SRL. מהירות ההדמיה של מיקרוסקופיה SRS היא סביב 2 μsec לפיקסל או 1 שנייה לכל מסגרת, וזה הרבה יותר מהר מאשר מיקרוסקופיה ראמאןספונטנית 11. רזולוציה רוחבית אופיינית עבור מיקרוסקופיה SRS מוגבלת עקיפה סביב 300 ננומטר. בנוסף, התהליכים האופטיים של שני פוטונים של מיקרוסקופיה SRS מאפשרים הדמיה תלת-ממדית נפחית של דגימות רקמה עבות יחסית ועומק ההדמיה יכול להגיע ל-300-500 מיקרומטר. בסך הכל, מיקרוסקופיה SRS מציגה טכניקת הדמיה יעילה, ללא תווית, כדי לזהות ביומולקולות ספציפיות, במיוחד שומנים.
טיפות השומנים הן אברונים חד-קרום, שהם אתר האחסון הסלולרי העיקרי עבור שומנים ניטרליים, כולל triacylglycerols (TAGs) ואסטרים כולסטרול (CEs). CH2 קשרים בשרשראות חומצות שומן של מולקולות השומנים האלה ליצור אותות SRS חזקים ב 2,845 ס”מ-1 כאשר נרגש8, ובכך מאפשר זיהוי וכימות של רמות השומנים אחסון בתאים שלמים, קטעי רקמות ואפילו אורגניזמים שלמים12,13,14,15. בפרט, C. elegans שימושיים עבור מחקרי הדמיה שומנים בשל השקיפות שלהם. כמו יונקים, C. elegans גם לאחסן שומנים טיפות השומנים ואת מסלולי סינתזה השפלה של מולקולות השומנים שמורים מאוד16. בפרוטוקול זה, אנו נספק את עקרון העבודה של מיקרוסקופיה SRS, ההתקנה הבסיסית שלה ולתאר את השיטות לשימוש בהדמיית שומנים ב- C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהגנה מפני השמנת יתר והפרעות מטבוליות הקשורות שלה, מאמצי מחקר חשובים יושמו כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הרגולטוריים של הומאוסטזיס השומנים. לגילוי כמותי של מולקולות שומנים בדגימות ביולוגיות, הדמיה ללא תווית על ידי מיקרוסקופיה SRS הוכח כחלופה אמינה מבחנים ביוכימיים ושיטות כתמים אחרות. ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), מרץ של קרן דימס (M.C.W.), קרן וולש (M.C.W.), ועל ידי חוקר HHMI (M.C.W.). אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) על זני C. elegans.
Materials
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. 유전학. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. 유전학. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
