Etikettfri bildbehandling av Lipid Storage Dynamics i Caenorhabditis elegans med stimulerad Raman Scattering Microscopy

Summary

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi möjliggör selektiv, etikettfri avbildning av specifika kemiska moieties och det har använts effektivt för att avbilda lipidmolekyler in vivo. Här ger vi en kort introduktion till principen om SRS mikroskopi och beskriver metoder för dess användning i imaging lipid lagring i Caenorhabditis elegans.

Abstract

Lipidmetabolism är en grundläggande fysiologisk process som är nödvändig för cellulär och organismhälsa. Dysregulation av lipidmetabolism framkallar ofta fetma och många associerade sjukdomar inklusive hjärt-kärlsjukdomar, typ II-diabetes och cancer. För att främja den nuvarande förståelsen av lipidmetabolisk reglering har kvantitativa metoder för att exakt mäta in vivo lipidlagringsnivåer i tid och rum blivit allt viktigare och användbarare. Traditionella metoder för att analysera lipid lagring är semi-kvantitativa för mikroskopisk bedömning eller saknar spatio-temporal information för biokemisk mätning. Stimulerad Raman-sprutmikroskopi (SRS) är en etikettfri kemisk bildteknik som möjliggör snabb och kvantitativ detektion av lipider i levande celler med subcellulär upplösning. Eftersom kontrasten utnyttjas från inneboende molekylära vibrationer tillåter SRS-mikroskopi också fyrdimensionell spårning av lipider hos levande djur. Under det senaste decenniet har SRS-mikroskopi använts i stor utsträckning för små molekylers avbildning i biomedicinsk forskning och övervinner de stora begränsningarna i konventionella fluorescerande färgning och lipidextraktionsmetoder. I laboratoriet har vi kombinerat SRS-mikroskopi med de genetiska och biokemiska verktyg som finns tillgängliga för den kraftfulla modellorganismen Caenorhabditis elegans för att undersöka fördelningen och heterogeniteten hos lipiddroppar över olika celler och vävnader och i slutändan upptäcka nya bevarade signalvägar som modulerar lipidmetabolism. Här presenterar vi arbetsprinciperna och den detaljerade inställningen av SRS-mikroskopet och tillhandahåller metoder för dess användning för att kvantifiera lipidlagring vid distinkta utvecklingsidpunkter för vilda och insulinsignalerande bristfällig mutant C. elegans.

Introduction

Fetma har blivit ett globalt hälsoproblem som hotar en tredjedel av befolkningen runt om i världen, och det utgör ett allvarligt medicinskt problem, med tanke på dess koppling till dålig psykisk^{hälsa 1} och dödliga sjukdomar inklusive diabetes², hjärt-kärlsjukdomar³ och vissa typer av cancer⁴. Studie av lipidmetabolism är avgörande för att bättre förstå de biologiska problemen bakom fetma. Snabb och specifik kvantifiering av lipidlagring innebär påvisande av fettsyror och deras derivat samt sterolhaltiga metaboliter, med hög känslighet och helst med rumslig information. Lipider utmanar mål att avbilda eftersom de saknar inneboende fluorescens och inte lätt kan fluorescerande taggas. De fluorescerande taggarna är ofta större än lipidmolekylerna och kan därför vara kemiskt invasiva och opraktiska för in vivo-applikationer. Etikettfri eller minimal märkningsstrategi är nödvändig för att bevara lipidmolekylens hydrofobiska struktur⁵. Den senaste utvecklingen inom bildteknik har skapat spännande möjligheter till etikettfri avbildning av lipider i levande celler, vävnader och organismer.

Traditionella metoder för lipidlagringsanalyser i biologiska prover inkluderar biokemiska analyser och färgningsprotokoll med lipofila färgämnen. Biokemiska kvantifieringsanalyser som involverar masspektrometri (MS) är oöverträffade i sin molekylära upplösning, men de kräver mycket stora provmängder och provberedning tar vanligtvis flera timmar, vilket begränsar deras tillämpning för realtidsavbildning av levande system⁵. En annan viktig begränsning av dessa analyser är bristen på rumslig information. Å andra sidan ger lipofila färgämnen som Oil Red O och Sudan Black vävnad och cellulär distribution av lipidlagringsorganeller och jämfört med MS-tekniker är dessa färgningsmetoder också låga i kostnad och lätta att utföra. Dessa färgningsprotokoll kräver dock fixering, vilket kan påverka lipiddroppornas hydrofobiska natur, generera konstgjorda förändringar i deras struktur och resultera i inkonsekvenser mellan experiment⁶. De tekniska svårigheterna i samband med biokemiska och färgning tekniker har lett till sökandet efter etikettfria metoder för att avbilda lipid molekyler och till den snabba ökningen av användningen av sammanhängande Raman spridning (CRS) mikroskopi i lipid imaging.

Raman-effekten erkändes först av Raman och Krishnan, där de rapporterade att när de interagerar med en foton kan en molekyl generera spridda ljus utan förändring i våglängd (kallad Rayleigh-spridning) eller sällan med en förändrad våglängd (kallad Raman-spridning) och denna förändring i våglängd är karakteristisk för de funktionella kemiska grupperna inom^{molekylen 7}. När kemikaliebindningarna i en molekyl blir upphetsade till en högre vibrationsenerginivå av en incidentfoton, kallad pumpfoton, blir energin hos den spridda fotonen, kallad Stokes foton, lägre. Annars kan de kemiska bindningarna nå en lägre vibrationsenerginivå om de ursprungligen är på en högre nivå, och den spridda fotonen får energi för att vara anti-Stokes foton. Frekvensskillnaden mellan incidenten och spridda fotoner kallas Raman-skiftet. Varje kemisk bindning i en molekyl har ett karakteristiskt och kvantifierbart Raman-skifte. Till exempel har CH_2-bindningen en Raman-förskjutning på 2 845 cm^-1, vilket är rikligt i fettsyrakedjor⁸. Denna spontana Raman signal är i allmänhet mycket svag, vilket har kraftigt begränsat bildhastigheten i konventionella spontana Raman mikroskopi. Under årens lopp har olika tillvägagångssätt utvecklats för att öka bildhastigheten och känsligheten hos spontan Raman-mikroskopi. Sammanhängande Raman spridning mikroskopi, inklusive sammanhängande Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) mikroskopi och stimulerad Raman Scattering (SRS) mikroskopi, är de senaste framstegen. CARS och SRS har lite olika arbetsprinciper, men båda är etikettfria tekniker som har levande bildkapacitet, kan ge rumslig och tidsmässig information om lipidlagringsdynamik och kräver endast liten provstorlek. CARS mikroskopi lider av icke-resonansbakgrund, som kommer från olika icke-linjära processer, och CARS-signaler har också icke-linjärt förhållande till molekylkoncentrationen, vilket tillsammans komplicerar kvantifieringsprocessen⁹. Till skillnad från CARS mikroskopi genererar SRS-mikroskopi inte icke-resonansfulla bakgrundssignaler och erbjuder linjärt beroende av koncentrationen av intressemolekylen. Således används för närvarande SRS mikroskopi mer allmänt för lipid imaging.

I SRS-mikroskopi kan de svaga spontana Raman-signalerna förstärkas när de upphetsades av två synkroniserade laserstrålar med deras frekvensskillnad som matchar den kemiska bindningsvibrationsfrekvensen. Molekylen kommer att uppleva en förbättrad övergång till ett upphetsad tillstånd på grund av sammanhängande excitation. Som ett resultat ökar andelen Stokes fotongeneration. Följaktligen ökar intensiteten hos den överförda “Stokes” -strålen (stimulerad Raman-förstärkning, SRG) och intensiteten hos den överförda “pump” -strålen minskar (stimulerad Raman-förlust, SRL). Detektion av SRG- eller SRL-signaler ligger till grund för SRS-mikroskopiavbildning (Stimulated Raman Scattering) med specifika kemiska^{bindningar 10}. Om frekvensskillnaden mellan de två laserstrålarna inte matchar den kemiska bindningens vibrationsfrekvens inom en molekyl av intresse, kommer varken SRG- eller SRL-signaler att genereras. Bildhastigheten för SRS-mikroskopi är cirka 2 μsec per pixel eller 1 sekund per bildruta, vilket är mycket snabbare än spontan Raman-mikroskopi¹¹. Typisk lateral upplösning för SRS mikroskopi är diffraktion begränsad och cirka 300 nm. Dessutom möjliggör de två-foton optiska processerna av SRS mikroskopi volymetrisk 3D-avbildning av relativa tjocka vävnadsprover och bilddjupet kan nå 300-500 μm. Sammantaget presenterar SRS-mikroskopi en effektiv, etikettfri bildteknik för att upptäcka specifika biomolekyler, särskilt lipider.

Lipiddroppar är enmembranorganeller, som är den huvudsakliga cellulära lagringsplatsen för neutrala lipider, inklusive triacylglyceroler (TAGs) och kolesterolestrar (CEs). CH₂ bindningar i fettsyrakedjorna i dessa lipidmolekyler genererar starka SRS-signaler vid 2 845 cm^-1 när de är^{upphetsade 8}, vilket möjliggör detektion och kvantifiering av lagringsfettnivåer i intakta celler, vävnadssektioner och till och med hela organismer^12,13,14,15. I synnerhet C. elegans är användbara för lipid imaging studier på grund av deras öppenhet. Liksom däggdjur lagrar C. elegans också lipider i lipiddroppar och syntes- och nedbrytningsvägarna för lipidmolekyler är mycket bevarade¹⁶. I detta protokoll kommer vi att tillhandahålla arbetsprincipen för SRS mikroskopi, dess grundläggande inställning och beskriva metoderna för dess användning i lipid imaging i C. elegans.

Protocol

1. Instrumentell inställning för stimulerad Raman Scattering Microscopy OBS: SRS-mikroskopisystemet är byggt på en picosecondlaser med pumpintegrerad optisk parametrisk oscillator och ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Oscillatorn tillhandahåller två picosecond pulståg, inklusive en Stokes-balk på 1 064 nm och en pumpstråle som kan finjusteras mellan 700-990 nm. Temporal och rumslig överlappning av de två strålarna uppnås inuti lasern. En inbyggd elektrooptisk modulator (EOM) ä…

Representative Results

Insulinsignalering är en viktig endokrin väg som påverkar utveckling, reproduktion, livslängd och ämnesomsättning. I maskar består insulinsignalering av cirka 40 insulinliknande peptidligands, insulinliknande tillväxtfaktorreceptor ortolog DAF-2, nedströms PI3K/ AKT kinas kaskad och FoxO transkription faktor ortolog, DAF-1620. daf-2 mutanter, som saknar insulinreceptorn, har fler lipiddroppar i tarmen, maskfettlagringsvävnaden21,<sup class="xre…

Discussion

För att skydda mot fetma och dess associerade metabola störningar har viktiga forskningsinsatser genomförts för att bättre förstå de regulatoriska mekanismerna för lipidhomeostas. För kvantitativ detektion av lipidmolekyler i biologiska prover har etikettfri avbildning genom SRS-mikroskopi visat sig vara ett tillförlitligt alternativ till biokemiska analyser och andra färgningsmetoder. Vår grupp och andra har avslöjat nya biologiska mekanismer i lipid metabolisk reglering genom att kombinera användningen <e…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP