Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie
Summary
Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.
Abstract
Lipidenmetabolisme is een fundamenteel fysiologisch proces dat nodig is voor de gezondheid van cellulaire en organismen. Dysregulatie van lipidenmetabolisme roept vaak obesitas en vele bijbehorende ziekten op, waaronder cardiovasculaire aandoeningen, diabetes type II en kanker. Om het huidige begrip van lipide metabole regulatie te bevorderen, zijn kwantitatieve methoden om in vivo lipidenopslagniveaus in tijd en ruimte nauwkeurig te meten steeds belangrijker en nuttiger geworden. Traditionele benaderingen voor het analyseren van lipidenopslag zijn semi-kwantitatief voor microscopische beoordeling of ontbreken spatio-temporele informatie voor biochemische meting. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie die snelle en kwantitatieve detectie van lipiden in levende cellen met een subcellulaire resolutie mogelijk maakt. Omdat het contrast wordt benut door intrinsieke moleculaire trillingen, maakt SRS-microscopie ook vierdimensionale tracking van lipiden bij levende dieren mogelijk. In het afgelopen decennium is SRS-microscopie veel gebruikt voor beeldvorming van kleine moleculen in biomedisch onderzoek en overwint het de belangrijkste beperkingen van conventionele fluorescerende kleurings- en lipideextractiemethoden. In het laboratorium hebben we SRS-microscopie gecombineerd met de genetische en biochemische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor het krachtige modelorganisme Caenorhabditis elegans, om de verdeling en heterogeniteit van lipidedruppels over verschillende cellen en weefsels te onderzoeken en uiteindelijk nieuwe geconserveerde signaleringsroutes te ontdekken die het lipidenmetabolisme moduleren. Hier presenteren we de werkprincipes en de gedetailleerde opstelling van de SRS-microscoop en bieden we methoden voor het gebruik ervan bij het kwantificeren van lipidenopslag op verschillende ontwikkelingsmomenten van wild-type en insulinesignaleringsdeficiënte mutant C. elegans.
Introduction
Obesitas is een wereldwijd gezondheidsprobleem geworden dat een derde van de bevolking over de hele wereld bedreigt, en het vormt een ernstige medische zorg, gezien de associatie met slechte geestelijke gezondheid1 en dodelijke ziekten, waaronder diabetes2,hart- en vaatziekten3 en sommige soorten kanker4. Studie van lipidenmetabolisme is essentieel om de biologische problemen achter obesitas beter te begrijpen. Snelle en specifieke kwantificering van lipidenopslag omvat de detectie van vetzuren en derivaten daarvan, evenals sterolhoudende metabolieten, met een hoge gevoeligheid en bij voorkeur met ruimtelijke informatie. Lipiden zijn uitdagende doelwitten om in beeld te brengen omdat ze intrinsieke fluorescentie missen en niet gemakkelijk fluorescerend kunnen worden getagd. De fluorescerende tags zijn vaak groter dan de lipidemoleculen en kunnen daarom chemisch invasief en onpraktisch zijn voor in vivo toepassingen. Labelvrije of minimale etiketteringsstrategie is noodzakelijk om de hydrofobe structuur van de lipidemoleculen te behouden5. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologieën hebben opwindende mogelijkheden gecreëerd voor labelvrije beeldvorming van lipiden in levende cellen, weefsels en organismen.
Traditionele benaderingen voor lipidenopslaganalyses in biologische monsters omvatten biochemische assays en kleuringsprotocollen met lipofiele kleurstoffen. Biochemische kwantificeringstesten met betrekking tot massaspectrometrie (MS) zijn ongeëvenaard in hun moleculaire oplosbaarheid, maar ze vereisen zeer grote monsterhoeveelheden en de monstervoorbereiding duurt meestal enkele uren, waardoor hun toepassing voor real-time beeldvorming van levende systemen wordt beperkt5. Een andere belangrijke beperking van deze assays is het gebrek aan ruimtelijke informatie. Aan de andere kant bieden lipofiele kleurstoffen zoals Oil Red O en Sudan Black weefsel- en cellulaire distributie van lipidenopslagorganellen en in vergelijking met MS-technieken zijn deze kleuringsmethoden ook goedkoop en gemakkelijk uit te voeren. Deze kleuringsprotocollen vereisen echter fixatie, wat de hydrofobe aard van de lipidedruppels kan beïnvloeden, kunstmatige veranderingen in hun structuur kan genereren en kan leiden tot inconsistenties tussen experimenten6. De technische problemen in verband met biochemische en kleuringstechnieken hebben geleid tot het zoeken naar labelvrije methoden om lipidemoleculen in beeld te brengen en tot de snelle toename van het gebruik van coherente Raman-verstrooiingsmicroscopie (CRS) in lipidebeeldvorming.
Het Raman-effect werd voor het eerst herkend door Raman en Krishnan, waar ze meldden dat bij interactie met een foton, een molecuul verspreid licht kan genereren zonder verandering in golflengte (rayleighverstrooiing genoemd) of zelden met een veranderde golflengte (raman-verstrooiing genoemd) en deze verandering in golflengte is kenmerkend voor de functionele chemische groepen binnen het molecuul7. Wanneer de chemische bindingen in een molecuul worden opgewekt tot een hoger trillingsenergieniveau door een incident foton, pompfoton genaamd, wordt de energie van het verspreide foton, het Stokes-foton, lager. Anders kunnen de chemische bindingen een lager trillingsenergieniveau bereiken als ze oorspronkelijk op een hoger niveau zijn, en het verspreide foton krijgt energie om het anti-Stokes-foton te zijn. Het frequentieverschil tussen het incident en verspreide fotonen staat bekend als de Raman-verschuiving. Elke chemische binding binnen een molecuul heeft een karakteristieke en kwantificeerbare Raman-verschuiving. De CH2-binding heeft bijvoorbeeld een Raman-verschuiving van 2.845 cm-1, die overvloedig aanwezig is in vetzuurketens8. Dit spontane Raman-signaal is over het algemeen erg zwak, wat de beeldsnelheid in conventionele spontane Raman-microscopie enorm heeft beperkt. In de loop der jaren zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om de beeldsnelheid en gevoeligheid van spontane Raman-microscopie te verhogen. Coherente Raman scattering microscopie, waaronder Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopie en Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopie, is de meest recente vooruitgang. CARS en SRS hebben iets andere werkprincipes, maar beide zijn labelvrije technieken die live beeldvormingscapaciteit hebben, ruimtelijke en temporele informatie kunnen opleveren over lipideopslagdynamiek en slechts een kleine steekproefgrootte vereisen. CARS-microscopie lijdt aan een niet-resonante achtergrond, die afkomstig is van verschillende niet-lineaire processen, en CARS-signalen hebben ook een niet-lineaire relatie met de molecuulconcentratie, die samen het kwantificeringsproces bemoeilijken9. In tegenstelling tot CARS-microscopie genereert SRS-microscopie geen niet-resonante achtergrondsignalen en biedt lineaire afhankelijkheid van de concentratie van het molecuul van belang. Dus, momenteel SRS microscopie wordt op grotere schaal gebruikt voor lipide beeldvorming.
In SRS-microscopie kunnen de zwakke spontane Raman-signalen worden versterkt wanneer ze worden opgewekt door twee gesynchroniseerde laserstralen met hun frequentieverschil dat overeenkomt met de trillingsfrequentie van de chemische binding. Het molecuul zal een verbeterde overgang naar een opgewonden toestand ervaren als gevolg van coherente excitatie. Als gevolg hiervan wordt de snelheid van de fotonengeneratie van Stokes verhoogd. Bijgevolg neemt de intensiteit van de overgedragen “Stokes”-bundel toe (gestimuleerde Raman-versterking, SRG) en neemt de intensiteit van de overgedragen “pomp”-bundel af (gestimuleerd Raman-verlies, SRL). Detectie van SRG- of SRL-signalen ligt ten grondslag aan de basis voor Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopiebeeldvorming van moleculen met specifieke chemische bindingen10. Als het frequentieverschil tussen de twee laserstralen niet overeenkomt met de trillingsfrequentie van de chemische binding binnen een molecuul van belang, worden er geen SRG- of SRL-signalen gegenereerd. De beeldsnelheid van SRS-microscopie is ongeveer 2 μsec per pixel of 1 seconde per frame, wat veel sneller is dan spontane Raman-microscopie11. Typische laterale resolutie voor SRS-microscopie is diffractie beperkt en ongeveer 300 nm. Bovendien maken de optische processen met twee fotonen van SRS-microscopie volumetrische 3D-beeldvorming van relatief dikke weefselmonsters mogelijk en kan de beelddiepte 300-500 μm bereiken. Over het algemeen presenteert SRS-microscopie een efficiënte, labelvrije beeldvormingstechniek om specifieke biomoleculen, met name lipiden, te detecteren.
Lipidedruppels zijn organellen met één membraan, de belangrijkste cellulaire opslagplaats voor neutrale lipiden, waaronder de triacylglycerolen (TAGs) en cholesterolesters (CE’s). CH2-bindingen in de vetzuurketens van deze lipidemoleculen genereren sterke SRS-signalen op 2.845 cm-1 wanneer zeopgewonden zijn 8, waardoor de opslaglipideniveaus in intacte cellen, weefselsecties en zelfs hele organismen12,13,14,15kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd . In het bijzonder zijn C. elegans nuttig voor lipidebeeldvormingsstudies vanwege hun transparantie. Net als zoogdieren slaan C. elegans ook lipiden op in lipidedruppels en de synthese- en afbraakroutes van lipidemoleculen zijn sterk geconserveerd16. In dit protocol zullen we het werkingsprincipe van SRS-microscopie, de fundamentele opstelling ervan, bieden en de methoden beschrijven voor het gebruik ervan in lipidebeeldvorming in C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ter verdediging tegen obesitas en de bijbehorende metabole stoornissen zijn belangrijke onderzoeksinspanningen geïmplementeerd om de regulerende mechanismen van lipidehomeostase beter te begrijpen. Voor kwantitatieve detectie van lipidemoleculen in biologische monsters is bewezen dat labelvrije beeldvorming door SRS-microscopie een betrouwbaar alternatief is voor biochemische assays en andere kleuringsmethoden. Onze groep en anderen hebben nieuwe biologische mechanismen in lipide metabole regulatie onthuld door het gebr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), en door HH.C.W.). We danken het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) voor C. elegans stammen.
Materials
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. 유전학. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. 유전학. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
