מאמר זה מציג שיטה ליצירת גבישי חלבון נגזר עם I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה) באמצעות microseeding כדי ליצור תנאי התגבשות חדשים במסכי מטריצה דלילה. ניתן להגדיר את המגשים באמצעות רובוטים לחלק נוזלים או ביד.
ההברה במבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן דורשת הן גבישי מפזר באיכות גבוהה והן פתרון חישובי של בעיית שלב ההתפוררות. מבנים חדשניים שאין להם מודל הומולוגיה מתאים נגזרים לעתים קרובות עם אטומים כבדים כדי לספק מידע שלב ניסיוני. הפרוטוקול המוצג מייצר ביעילות גבישי חלבון נגזרים על ידי שילוב של הקרנת מטריצת microseeding אקראית עם נגזרת עם מולקולת אטום כבדה I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה). על-ידי שילוב I3C לתוך סריג הגביש, ניתן לפתור ביעילות את בעיית שלב ההתפזרות באמצעות פיזור חריג באורך גל יחיד (SAD). סידור המשולש ההשוותי של אטומי יוד ב- I3C מאפשר אימות מהיר של תת-מבנה חריג נכון. פרוטוקול זה יהיה שימושי ביולוגים מבניים לפתור מבנים מקרומולקולריים באמצעות טכניקות מבוססות קריסטלוגרפיה עם עניין phasing ניסיוני.
בתחום הביולוגיה המבנית, קריסטלוגרפיה רנטגן נחשבת טכניקה סטנדרטית זהב כדי לקבוע את המבנים ברזולוציה אטומית של מקרומולקולות. זה כבר נוצל בהרחבה כדי להבין את הבסיס המולקולרי של מחלות, מדריך פרויקטים עיצוב תרופה רציונלית ולהאריך את המנגנון הקטליטישל אנזימים 1,2. למרות שנתונים מבניים מספקים שפע של ידע, תהליך ביטוי וטיהור חלבונים, התגבשות וקביעת מבנה יכול להיות מייגע ביותר. מספר צווארי בקבוק נתקלים בדרך כלל כי לעכב את ההתקדמות של פרויקטים אלה וזה חייב להיות ממוען ביעילות לייעל ביעילות את צינור קביעת מבנה גביש.
בעקבות ביטוי רקומביננטי וטיהור, יש לזהות תנאים ראשוניים התגבשות אשר לעתים קרובות היבט מפרך וגוזל זמן של גבישים רנטגן. מסכי מטריצה ודלילה מסחריים המאחדים תנאים ידועים ופורסמו פותחו כדי להקל על צוואר בקבוקזה 3,4. עם זאת, זה נפוץ לייצר כמה להיטים מהסכים הראשוניים האלה למרות שימוש בדגימות חלבון טהורות ומרוכזות מאוד. התבוננות בטיפות ברורות מצביעה על כך שהחלבון לא יכול להגיע לרמות של שינון העל הנדרש כדי לגרום גביש. כדי לעודד גרעין קריסטל וצמיחה, ניתן להוסיף זרעים מופקים מקריסטלים קיימים מראש לתנאים וזה מאפשר דגימה מוגברת של מרחב התגבשות. איירטון וסטודרד הציגו לראשונה את שיטת הסינון של מטריצתהמיקרו-זרעים 5. גבישים באיכות ירודה נמחצו כדי ליצור מלאי זרעים ולאחר מכן נוספו באופן שיטתי לתנאי התגבשות המכילים מלחים שונים כדי ליצור גבישים חדשים באיכות iffraction שלא היו נוצרים אחרת. טכניקה זו שופרה עוד יותר על ידי D’Arcy ואח’, שפיתחה הקרנה אקראית של מטריצת microseed (rMMS) שבה זרעים הוכנסולמסך התגבשות מטריצה רזרבי 6,7. זה שיפר את איכות הגבישים והגביר את מספר להיטי ההתגבשות בממוצע על ידי גורם של 7.
לאחר יצירת גבישים בהצלחה ומתקבלת תבנית פעירת רנטגן, נתקלים צוואר בקבוק נוסף בצורה של פתרון ‘בעיית פאזה’. במהלך תהליך רכישת הנתונים, עוצמת iffraction (פרופורציונלי לריבוע של משרעת) נרשם אבל מידע השלב הולך לאיבוד, מה שנועץ לבעיית השלבים העוצרת קביעת מבנה מיידית8. אם חלבון היעד חולק זהות רצף גבוה לחלבון עם מבנה שנקבע קודם לכן, ניתן להשתמש בתחליף מולקולרי כדי להעריך אתמידע שלב 9,10,11,12. למרות ששיטה זו מהירה וזולת, ייתכן שמבני המודל לא יהיו זמינים או מתאימים. ההצלחה של שיטת החלפת מולקולרית מבוססת מודל הומולוגיה יורדת באופן משמעותי כמו זהות רצף נופל מתחת 35%13. בהיעדר מודל הומולוגיה מתאים, ניתן לבדוק שיטות ab initio, כגון ARCIMBOLDO14,15 ו- AMPLE16. שיטות אלה משתמשות במודלים או שברים חזויים חישוביים כנקודות התחלה להחלפה מולקולרית. AMPLE, המשתמשת במודלים דמה חזוי כנקודות התחלה, נאבקת לפתור מבנים של חלבונים גדולים (>100 שאריות) וחלבונים המכילים בעיקר β שונים. ARCIMBOLDO, אשר מנסה להתאים שברים קטנים כדי להרחיב לתוך מבנה גדול יותר, מוגבל לנתונים ברזולוציה גבוהה (≤2 Å) ועל ידי היכולת של אלגוריתמים להרחיב את השברים למבנה מלא.
אם שיטות החלפה מולקולריות נכשלות, יש להשתמש בשיטות ישירותכגוןהחלפת איזומורפית17,18 ופיזור חריג באורך גל יחיד (SAD19)או באורכי גל מרובים (MAD20). זה לעתים קרובות המקרה עבור מבנים חדשניים באמת, שבו הגביש חייב להיווצר או נגזר עם אטום כבד. זה יכול להיות מושגת על ידי השריה או שיתוף התגבשות עם תרכובת אטום כבד, שינוי כימי (כגון 5-bromouracil התאגדות ב RNA) או ביטוי חלבון מתויג (כגון שילוב חומצות סלנומטיונין או selenocysteine אמינו לתוך המבנה הראשי)21,22. הדבר מסבך עוד יותר את תהליך ההתגבשות ודורש סינון ואופטימיזציה נוספים.
מחלקה חדשה של תרכובות phasing, כולל I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה) ו B3C (5-אמינו-2,4,6-tribromoisophthalic חומצה), מציעים יתרונות מרגשים על פני תרכובות phasing קייםמראש 23,24,25. הן I3C והן B3C כוללים פיגום טבעת ארומטי עם סידור לסירוגין של פיזורים חריגים הנדרשים עבור שיטות phasing ישיר וקבוצות פונקציונליות אמינו או קרבוקסילטים אינטראקציה ספציפית עם החלבון ולספק ספציפיות אתר מחייב. הסידור המשולש ההשוותי הבא של קבוצות מתכת כבדה מאפשר אימות פשוט יותר של מבנה המשנה phasing. בעת איסוף החומר למדריך, ישנם 26 מבנים המאוגדים ב- I3C בבנק נתוני החלבון (PDB), מהם 20 נפתרו באמצעות phasing SAD26.
פרוטוקול זה משפר את היעילות של צינור קביעת מבנה על ידי שילוב השיטות של נגזרת מתכת כבדה והקרנת rMMS כדי להגדיל בו זמנית את מספר להיטי התגבשות ולפשט את תהליך גביש derivatization. הראינו ששיטה זו הייתה יעילה מאוד עם ליזוים לבנים ביצה ותחום של חלבון ליצין חדשני מבקטריופט P6827. פתרון מבנה באמצעות צינור קביעת מבנה אוטומטי-ריקשה אוטומטי מאוד מתואר, מותאם במיוחד עבור מתחם phasing I3C. קיימים צינורות אוטומטיים אחרים שניתן להשתמש בהם כגון AutoSol28, ELVES29 ו- CRANK230. ניתן להשתמש גם בחבילות לא אוטומטיות לחלוטין כגון SHELXC/D/E31,32,33. שיטה זו מועילה במיוחד לחוקרים החוקרים חלבונים חסרי מודלים הומולוגיים ב-PDB, על ידי צמצום משמעותי של מספר שלבי הסינון והאופטימיזציה. תנאי מוקדם לשיטה זו הוא גבישי חלבון או משקע גבישי של חלבון היעד, שהושג מניסויים קודמים התגבשות.
קביעת מבנה של חלבון חדשני בהיעדר מודל הומולוגיה מתאים להחלפה מולקולרית דורשת ניסויים. שיטות אלה דורשות התאגדות של אטומים כבדים לתוך גביש החלבון אשר מוסיף רמה של מורכבות לצינור קביעת מבנה יכול להציג מכשולים רבים שיש לטפל. אטומים כבדים יכולים להיות משולבים ישירות לתוך החלבון באמצעות ביטוי מתויג באמצעות סלנומטיונין וסלנוצישטאין. מכיוון ששיטה זו יקרה, מייגעת עלולה לגרום לתפוקות חלבון נמוכות יותר, חלבון מתויג מתבטא לעתים קרובות לאחר שנמצאו תנאי התגבשות ואופטימיזציה עם חלבון ללא תווית. לחלופין, ניתן להפיק קריסטלים על-ידי השריה בתמיסה המכילהאטומים כבדים 22,63,64. שיטה זו משתמשת לעתים קרובות גבישים באיכות גבוהה ולכן מבוצעת לאחר שיטת התגבשות חזקה כבר פותחה. בהצלחה להשיג גביש נגזר באמצעות שיטה זו דורש אופטימיזציה נוספת של הליכי השריה והקרנה של תרכובות phasing שונות, ולכן הוספת זמן נוסף לתהליך מייגע כבר.
התגבשות משותפת של החלבון עם האטום הכבד יכולה להתבצע בשלב ההקרנה, ובכך לייעל ביעילות את התהליך ולהפחית את צעדי המניפולציה הגבישית שיכולים לגרום נזק. עם זאת, עדיין קיים התרחיש הפוטנציאלי של השגת כמה להיטי התגבשות ראשוניים ואת הבעיה של בחירת תרכובת אטום כבד תואם. תרכובות phasing רבות הזמינות כיום אינן תואמות עם מקדים, מאגרים ותוספים נמצאים בדרך כלל בתנאי התגבשות. הם עשויים להיות מסיסים במאגרי גופרית ופוספט, chelate כדי ציטראט ואצטט, להגיב שלילי עם HEPES וטריס מאגרים או להיות מבודד על ידי DTT ו β-mercaptoethanol21. כמו תרכובת phasing I3C אינו סובל מאי-תואמות אלה, זה תרכובת phasing חזקה שיכול להיות מותנה לתנאים רבים ושונים.
במחקר זה, שיטה יעילה של ייצור גבישים נגזרים מוכן phasing SAD באמצעות התגבשות בו-זמנית של תרכובת phasing I3C ו rMMS מוצג. השילוב של שתי הטכניקות מגדיל את מספר להיטי ההתגבשות, כאשר רבים מהתנאים שיפרו את מאפייני המורפולוגיה וההתפכה. הן במקרי בדיקה של Orf11 NTD והן במקרי בדיקת HEWL, זוהו תנאים חדשים במסך I3C-rMMS שנעדרו כאשר I3C לא היה נוכח. פוטנציאל, I3C עשוי להיקשר לטובה לחלבון, להקל על היווצרות וייצוב של מגעים גביש27. בתורו, זה עלול לגרום התגבשות ואולי לשפר את מאפייני ההתגבשות. מלבד היותו מתחם תואם מסכי מטריצה דלילה, I3C הוא גם מתחם phasing אטרקטיבי בשל המאפיינים הפנימיים שלה. הקבוצות הפונקציונליות המחליפיות עם יוד על פיגום הטבעת הארומטי מאפשרות כריכה ספציפית לחלבונים. זה מוביל לתפוסה גדולה יותר ועלול להפחית את אות הרקע23. יתר על כן, הסידור של מפזרים חריגים במשולש שווה צלעות ברור בתת-מבנה וניתן להשתמש בו כדי לאמת במהירות איגוד של I3C (איור 4B ו- 4C). לבסוף, הוא יכול לייצר אות חריג עם קרינת סינכרוטרון tunable, כמו גם כרום ונחושת מסתובב מקורות רנטגן אנודה. לכן, ניתן להחיל אותו על זרימות עבודה רבות ושונות. כמו I3C זמין נרחב ולא יקר לרכישה, גישה זו היא בהישג יד עבור רוב מעבדות ביולוגיה מבנית.
קיימים מספר שיקולים ניסיוניים שיש לטפל בהם בעת שימוש בשיטת I3C-rMMS. אין אפשרות להחיל שיטה זו אם לא ניתן להשיג חומר גבישי ראשוני של החלבון. במקרים קשים, חומר גבישי מחלבון הומולוגי יכול לשמש גם כדי ליצור מלאי זרעים. גישה זו צולבת זרעים rMMS הראה כמה תוצאות מבטיחות7. אופטימיזציה של מספר גביש באמצעות דילול של מלאי הזרעים היא צעד מכריע, אשר אין להתעלם, כדי למקסם את הסיכוי לייצר גבישים גדולים באיכות גבוהה ורכישת נתוני iffraction מתאימים. אם יש מעט אתרי I3C שזוהו ביחידה האסימטרית, יש למטב את התנאים התגבשות עוד יותר עם ריכוז מוגבר של I3C. זה עשוי להגדיל את התפוסה של I3C כדי למקסם את האות החריג ולסייע גביש נגזר.
יכולים להיות מקרים שבהם טכניקה זו לא יכולה להיות השיטה האופטימלית כדי להפיק גבישי חלבון. ככל שגודלו של חלבון או קומפלקס חלבון גדל, המספר המוגבל של אתרי I3C על פני השטח של החלבון לא יכול לספק מספיק כוח phasing כדי לפתור את המבנה. בתרחישים אלה שבהם גודל החלבון חשוד להיות phasing, תיוג סלנומתיון של החלבון עשוי להיות גישה בת קיימא יותר כדי phasing החלבון. אם החלבון יש מספר מספיק של שאריות מתיונין בחלבון (מומלץ שיש לפחות מתיונין אחד לכל 100שאריות 65) ויעילותגבוהה התאגדות סלנומתיונין לתוך חלבון ניתן להשיג (כגון במערכות ביטויחיידקים 66), אטומי סלניום תפוסה גבוהה מרובים יהיו נוכחים גבישים לשלב את המבנה.
בנוסף, חלבונים מסוימים עשויים מטבעם להיות לא מתאימים לדריבעה עם I3C. אתרי איגוד I3C על חלבונים תלויים במבנה החלבון. ייתכנו חלבונים שבאופן טבעי יש כמה תיקונים חשופים תואמים לאיגוד I3C. לכן, זה לא בלתי צפוי כי ייתכנו קשיים בהתגבשות חלק חלבוני היעד עם I3C.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נערך על קו הקרן MX1 ב Synchrotron האוסטרלי, חלק ANSTO. המחברים רוצים להכיר חברים במעבדות שירווין וברונינג לדיונים על עבודה זו. המחברים רוצים גם להכיר ד”ר סנטוש Panjikar וד”ר לינדה Whyatt-Shearwin שתרמו לעבודה המקורית שהייתה חלוצה פרוטוקול זה.
המימון הבא מוכר: מועצת המחקר האוסטרלית (להעניק Nos. DP150103009 ו- DP160101450 לקית’ א. שירווין); אוניברסיטת אדלייד (תוכנית ההכשרה הממשלתית האוסטרלית למחקר מלגה ג’יה קויין טרונג וסטפני נגוין).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |