Misurazione massima della forza tetanica isometrica del muscolo anteriore tibiale nel ratto

Summary

La valutazione del recupero motorio rimane la misura di risultato di riferimento negli studi sperimentali sui nervi periferici. La misurazione della forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto è uno strumento inestimabile per valutare gli esiti funzionali dopo la ricostruzione dei difetti nervosi sciatici. I metodi e le sfumature sono dettagliati in questo articolo.

Abstract

Le lesioni nervose traumatiche si traducono in una sostanziale perdita funzionale e difetti nervosi segmentali spesso richiedono l’uso di innesti nervosi di interposizione autologa. A causa della loro limitata disponibilità e della morbilità laterale associata del donatore, molti studi nel campo della rigenerazione nervosa si concentrano su tecniche alternative per colmare un gap nervoso segmentale. Al fine di indagare i risultati delle opzioni di trattamento sperimentale chirurgico o farmacologico, il modello di nervo sciatico del ratto è spesso usato come saggio biologico. Esistono una varietà di misurazioni dei risultati utilizzate nei modelli di ratto per determinare l’estensione della rigenerazione nervosa. La forza massima di uscita del muscolo bersaglio rimane il risultato più rilevante per la traduzione clinica di terapie sperimentali. La misurazione isometrica della forza della contrazione muscolare tetanica è stata precedentemente descritta come una tecnica riproducibile e valida per valutare il recupero motorio dopo la lesione nervosa o la riparazione sia nei modelli di ratto che di coniglio. In questo video, forniremo un’istruzione passo-passo di questa procedura inestimabile per la valutazione del recupero funzionale del muscolo anteriore tibiale in un modello di difetto del nervo sciatico del ratto utilizzando parametri ottimizzati. Descriveremo i necessari preparati pre-chirurgici oltre all’approccio chirurgico e alla dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare anteriore tibialis. La tecnica di misurazione della forza tetanica isometrica sarà dettagliata. Viene spiegato determinare la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell’impulso di stimolo e misurare la massima contrazione muscolare tetanica.

Introduction

La perdita della funzione motoria a seguito di lesioni traumatiche del nervo periferico ha un impatto significativo sulla qualità della vita e sullo stato^{socioeconomico dei pazienti 1,2,3}. La prognosi di questa popolazione di pazienti rimane scarsa a causa di miglioramenti minimi nelle tecniche chirurgiche nel corso degli anni⁴. La riparazione epineurale diretta end-to-end senza tensione forma la ricostruzione chirurgica gold standard. Tuttavia, nei casi con intervalli nervosi estesi l’interposizione di un innesto nervoso autologo si è dimostrata^{superiore a 5,6}. La morbilità del sito donatore associato e la limitata disponibilità di innesti nervosi autologi hanno imposto la necessità di tecniche alternative^7,8.

Modelli animali sperimentali sono stati utilizzati per chiarire il meccanismo di rigenerazione dei nervi periferici e per valutare i risultati di una varietà di opzioni di trattamento ricostruttivo e^{farmacologico 8,9}. Il modello di nervo sciatico del ratto è il modello animale^{10 più frequentemente utilizzato.} Le loro piccole dimensioni li rendono facili da maneggiare e ospitare. A causa del loro potenziale neuroregenerativo superlativo, il tempo ridotto tra l’intervento e la valutazione dei risultati può comportare costi^{relativamente inferiori 11,12}. Altri vantaggi del suo uso includono somiglianze morfologiche con le fibre nervose umane e l’alto numero di studi comparativi / storici¹³. Sebbene questi ultimi debbano essere avvicinati con cautela, poiché un’ampia varietà di diverse misure di risultato tra gli studi rende difficile confrontare^{i risultati 14,15,16,17,18}.

Le misure di risultato per valutare la rigenerazione nervosa vanno dall’elettrofisiologia all’istomorfometria, ma questi metodi implicano una correlazione ma non misurano necessariamente direttamente il^{ritorno della funzione motoria 14,15}. Le fibre nervose rigeneranti potrebbero non creare connessioni appropriate che possono causare una sopravvalutazione del numero di connessioni funzionali^14,15,19,20. La misurazione migliore e clinicamente più rilevante per dimostrare la corretta reinnervazione degli organi finali rimane la valutazione della funzione^{muscolare 21,22,23}. La creazione di strumenti di valutazione delle funzioni motorie per i modelli animali è, tuttavia, impegnativa. ha descritto per la prima volta l’analisi della pista da passeggio, che da allora è stato il metodo più frequentemente utilizzato per valutare il recupero funzionale negli studi sperimentali sui nervi periferici^21,24,^{25, 26,27,28}. L’analisi della pista da passeggio quantifica l’indice funzionale sciatico (SFI) sulla base delle misurazioni delle impronte delle zampe dei ratti che^{camminano 21,29}. Le principali limitazioni dell’analisi dei sentieri, come le contratture, l’automutilazione, lo sbavatura della stampa e la scarsa correlazione con altre misure di reinnervazione, hanno reso necessario l’uso di altri parametri per la quantificazione del^{recupero funzionale 30,31}.

In precedenti studi su ratti Lewis^{32 e} conigli neozelandesi³³, abbiamo convalidato la misurazione della forza tetanica isometrica (ITF) per il muscolo tibiale anteriore (TA) e dimostrato la sua efficacia nella valutazione del recupero muscolare dopo diversi tipi di^{riparazione nervosa 34,35,36,37,38,39}. Il muscolo TA è adatto a causa delle sue dimensioni relativamente grandi, innervazione da parte del ramo peroneale del nervo sciatico e proprietà biochimiche ben chiarite^40,41,42,43. Quando la lunghezza muscolare (forza di precarico) e i parametri elettrici sono ottimizzati, l’ITF fornisce una variabilità side-to-side del 4,4% e del 7,5% rispettivamente^{nei ratti 32 e nei conigli 33.}

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato della misurazione ITF nel modello del nervo sciatico del ratto, inclusa una descrizione approfondita della necessaria pianificazione pre-chirurgica, approccio chirurgico e dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare TA distale. Utilizzando valori predeterminati per l’intensità e la durata dello stimolo, verrà definita la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell’impulso di stimolo. Con questi quattro parametri, l’ITF può essere successivamente misurato in modo coerente e accurato.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l’approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC A334818). 1. Taratura del trasduttore di forza Assicurarsi che il computer sia correttamente collegato al dispositivo daq (Multifunctional I/O Data Acquisition) USB-6009, che a sua volta deve essere collegato al trasduttore di forza.NOTA: Altri ceppi e specie di ratti possono richiedere un trasduttore di forza delle cellule di carico diverso,…

Representative Results

Cinque parametri vengono utilizzati per misurare la misurazione ITF. Questi includono tensione muscolare (forza di precarico), intensità di stimolo (tensione), frequenza dell’impulso di stimolo, durata dello stimolo di 0,4 ms e un ritardo di 2 ms. Prima di misurare l’ITF, la tensione muscolare ottimale deve essere determinata utilizzando due contrazioni muscolari a contrazione singola ad un’intensità di 2 V durante il test dei parametri. Questi stimoli causano la dorsiflessione della zampa e producono un segnale di usc…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo precedentemente convalidato per acquisire misurazioni ITF massime accurate del muscolo TA nel modello di ratto³². Il recupero della massima forza dopo trattamenti sperimentali di ricostruzione nervosa è di primario interesse nell’ambiente clinico in quanto dimostra che il nervo non solo si è rigenerato, ma ha anche fatto connessioni di lavoro con il muscolo bersaglio. L’ITF può essere utilizzato in un piccolo modello di nerve gap, come il ratto sciatico nerv…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA	G130203
1 mm Kirshner wires	Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ	N/A
Adson Tissue Forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-6801226
Bipolar electrode cables	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Bipolar stimulator device	Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Cotton-tip Applicators	Cardinal Health, Waukegan, IL, USA	C15055-006
Curved Mosquito forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5	Transducer Techniques, Temecula, CA	N/A
Gauze Sponges 4×4	Covidien, Mansfield, MA, USA	2733
Ground cable	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Isoflurane chamber	N/A	N/A	Custom-made
Ketamine	Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ	42023-115-10
LabView Software	National Instruments, Austin, TX
Loop	N/A	N/A	Custom-made
Microsurgical curved forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JFA-5B
Microsurgical scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JF-3
Retractor	ASSI, Westbury, NY, USA	AG-124426
Scalpel Blade No. 15	Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA	371115
Slim Body Skin Stapler	Covidien, Mansfield, MA, USA	8886803512
Subminiature electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	N/A
Surgical Nerve Stimulator	Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA	9094
Terrell Isoflurane	Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA	H961J19A
Testing platform	N/A	N/A	Custom-made
Tetontomy Scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device	National Instruments, Austin, TX	779026-01
Vacuum Base Holder	Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal	N/A	Attached clamp is custom-made
Weight (10 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820010.4
Weight (20 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820020.4
Weight (50 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820050.4
Xylazine	Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada	1XYL002