Quantificazione dell'organizzazione del collagene fibrilla con strumenti a base di trasformata curvelet

Summary

Qui presentiamo un protocollo per utilizzare uno strumento software MATLAB open source a base di trasformata curvelet per quantificare l’organizzazione del collagene fibrilla nella matrice extracellulare dei tessuti normali e malati. Questo strumento può essere applicato a immagini con fibre di collagene o altri tipi di strutture simili a linee.

Abstract

I collageni fibrillari sono componenti prominenti della matrice extracellulare (ECM) e i loro cambiamenti di topologia hanno dimostrato di essere associati alla progressione di una vasta gamma di malattie tra cui tumori al seno, alle ovaie, ai reni e al pancreas. Gli strumenti software di quantificazione delle fibre liberamente disponibili si concentrano principalmente sul calcolo dell’allineamento o dell’orientamento della fibra e sono soggetti a limitazioni come il requisito di passaggi manuali, imprecisione nel rilevamento del bordo della fibra in uno sfondo rumoroso o mancanza di caratterizzazione localizzata delle funzionalità. Lo strumento di quantificazione delle fibre di collagene descritto in questo protocollo è caratterizzato dall’utilizzo di una rappresentazione ottimale dell’immagine su più scale abilitata dalla trasformazione curvelet (CT). Questo approccio algoritmico consente la rimozione del rumore dalle immagini di collagene fibrilla e il miglioramento dei bordi delle fibre per fornire informazioni sulla posizione e sull’orientamento direttamente da una fibra, piuttosto che utilizzare le informazioni indirette per pixel o per finestra ottenute da altri strumenti. Questo framework basato su CT contiene due pacchetti separati, ma collegati, denominati “CT-FIRE” e “CurveAlign” in grado di quantificare l’organizzazione delle fibre su base globale, regione di interesse (ROI) o singola fibra. Questo quadro di quantificazione è stato sviluppato per più di dieci anni e ora si è evoluto in una piattaforma di quantificazione del collagene completa e guidata dall’utente. Utilizzando questa piattaforma, si possono misurare fino a una trentina di caratteristiche della fibra tra cui proprietà individuali della fibra come lunghezza, angolo, larghezza e rettilineità, nonché misurazioni alla rinfusa come densità e allineamento. Inoltre, l’utente può misurare l’angolo della fibra rispetto ai limiti segmentati manualmente o automaticamente. Questa piattaforma fornisce anche diversi moduli aggiuntivi tra cui quelli per l’analisi del ROI, la creazione automatica dei limiti e la post-elaborazione. L’utilizzo di questa piattaforma non richiede una precedente esperienza di programmazione o elaborazione delle immagini e può gestire set di dati di grandi dimensioni tra cui centinaia o migliaia di immagini, consentendo una quantificazione efficiente dell’organizzazione delle fibre di collagene per applicazioni biologiche o biomediche.

Introduction

I collageni fibrillari sono componenti ECM strutturali prominenti. La loro organizzazione cambia la funzione tissutale di impatto e sono probabilmente associati alla progressione di molte malattie che vanno dall’osteogenesi imperfetta^1,disfunzione cardiaca²e guarigione^{delle ferite 3} a diversi tipi di cancro tra cui^{il seno 4,5,6,}ovarico^{7,8,rene 9}e tumori pancreatici¹⁰. Molte modalità di imaging consolidate possono essere utilizzate per visualizzare collagene fibrilla come microscopia di seconda generazione^{armonica 11,}macchie o coloranti in combinazione con microscopia a campo luminoso o fluorescenza o microscopia a luce polarizzata^12,microscopia a polarizzazione a cristalli liquidi (LC-PolScope)¹³e microscopia elettronica¹⁴. Man mano che l’importanza dell’organizzazione del collagene fibrilla è diventata più chiara e l’uso di questi metodi è aumentato, è cresciuta anche la necessità di migliori approcci di analisi delle fibre di collagene.

Ci sono stati molti sforzi per sviluppare metodi computazionali per la misurazione automatizzata del collagene fibrilla. Gli strumenti software liberamente disponibili si concentrano principalmente sul calcolo dell’allineamento o dell’orientamento della fibra adottando il primo tensore derivato o di struttura per i pixel^15,16o l’analisi dello spettro basata sulla trasformazione di Fourier per i riquadri^{immagine 17}. Tutti questi strumenti sono soggetti a limitazioni come il requisito di passaggi manuali, imprecisione nel rilevamento del bordo della fibra in uno sfondo rumoroso o mancanza di caratterizzazione localizzata delle funzionalità.

Rispetto ad altri strumenti software liberi open source liberamente disponibili, i metodi descritti in questo protocollo utilizzano ct, un metodo ottimale, multiscala, di rappresentazione direzionale dell’immagine, per rimuovere il rumore dalle immagini di collagene fibrillare e migliorare o tracciare i bordi delle fibre. Le informazioni sulla posizione e l’orientamento possono essere fornite direttamente da una fibra piuttosto che utilizzando le informazioni indirette per pixel o per finestra per dedurre le metriche dell’organizzazione delle fibre. Questo framework basato su CT^{18,19,20,21 può} quantificare l’organizzazione della fibra su base globale, ROI o fibra, principalmente tramite due pacchetti separati, ma collegati, denominati “CT-FIRE”^18,21 e “CurveAlign”^19,21. Per quanto riguarda l’implementazione del software, in CT-FIRE, i coefficienti CT su più scale possono essere utilizzati per ricostruire un’immagine che migliora i bordi e riduce il rumore. Quindi, un singolo algoritmo di estrazione della fibra viene applicato all’immagine ricostruita dalla TC per tenere traccia delle fibre per trovare i loro punti di centro rappresentativi, estendere i rami di fibra dai punti centrale e collegare i rami di fibra per formare una rete in fibra. In CurveAlign, i coefficienti CT su una scala specificata dall’utente possono essere utilizzati per tenere traccia dell’orientamento della fibra locale, dove l’orientamento e le posizioni delle curvelet vengono estratti e raggruppati per stimare l’orientamento della fibra nelle posizioni corrispondenti. Questo quadro di quantificazione risultante è stato sviluppato per più di dieci anni e si è evoluto notevolmente in molti aspetti come la funzionalità, l’interfaccia utente e la modularità. Ad esempio, questo strumento può visualizzare l’orientamento della fibra locale e consente all’utente di misurare fino a trenta caratteristiche della fibra, tra cui proprietà individuali della fibra come lunghezza, angolo, larghezza e rettilineità, nonché misurazioni di massa come densità e allineamento. Inoltre, l’utente può misurare l’angolo della fibra rispetto ai limiti segmentati manualmente o automaticamente, il che, ad esempio, svolge un ruolo importante nello sviluppo di biomarcatori basati su immagini nel cancro al seno²² e negli studi sul cancro al pancreas¹⁰. Questa piattaforma fornisce diversi moduli di funzionalità, tra cui quelli per l’analisi del ROI, la creazione automatica dei limiti e la post-elaborazione. Il modulo ROI può essere utilizzato per annotare diverse forme di ROI e condurre analisi del ROI corrispondenti. Ad esempio, il modulo automatico di creazione dei limiti può essere utilizzato per registrare immagini a campo luminoso ematossilina ed eosina (H&E) con immagini di seconda generazione armonica (SHG) e generare la maschera immagine dei confini tumorali dalle immagini H&E registrate. Il modulo di post-elaborazione può aiutare a facilitare l’elaborazione e l’integrazione di file di dati di output da singole immagini per possibili analisi statistiche.

Questa piattaforma di quantificazione non richiede una precedente esperienza di programmazione o elaborazione delle immagini e può gestire set di dati di grandi dimensioni tra cui centinaia o migliaia di immagini, consentendo una quantificazione efficiente dell’organizzazione del collagene per applicazioni biologiche o biomediche. È stato ampiamente utilizzato in diversi campi di ricerca da molti ricercatori in tutto il mondo, incluso noi stessi. Ci sono quattro pubblicazioni principali su CT-FIRE e CurveAlign^18,19,20,21, di cui le prime tre sono state citate 272 volte (a 2020-05-04 secondo Google Scholar). Una recensione delle pubblicazioni che hanno citato questa piattaforma (CT-FIRE o CurveAlign) indica che ci sono circa 110 articoli di riviste che l’hanno utilizzata direttamente per la loro analisi, in cui circa 35 pubblicazioni sono state collaborative con il nostro gruppo e le altre (~ 75) sono state scritte da altri gruppi. Ad esempio, questa piattaforma è stata utilizzata per i seguenti studi: tumore al^{seno 22,23,24}, tumore al pancreas^10,25,cancro ai^{reni 9,26,}guarigione delle^{ferite 3,27,28,29,30,}cancro alle ovaie^8,31,7, legamento uterosacrale 32, dentina ipofosfatmica^32,dentina ipofosfatmica33 , carcinoma a cellule basali^34,sarcoma ipossico^35,tessuto cartilagineo^36,disfunzione cardiaca^37,neuroni^38,glioblastoma^39,contrazioni linfatiche^40,cacffold fibrosi^41,cancro gastrico^42,microtubulo⁴³e fibrosi^{vescicale 44}. La figura 1 dimostra l’applicazione di imaging tumorale di CurveAlign per trovare le firme di collagene associate al tumore del cancro al^{seno 19} dall’immagine SHG. Nella figura 2 viene descritto un flusso di lavoro schematico tipico di questa piattaforma. Sebbene questi strumenti siano stati esaminati tecnicamente^18,19,21e un normale protocollo^{20 per l’analisi} dell’allineamento con CurveAlign, potrebbe essere utile anche un protocollo visivo che dimostri tutte le funzionalità essenziali. Un protocollo visualizzato, come presentato qui, faciliterà il processo di apprendimento dell’utilizzo di questa piattaforma e affronterà in modo più efficiente i problemi e le domande che gli utenti potrebbero avere.

Protocol

NOTA: Questo protocollo descrive l’uso di CT-FIRE e CurveAlign per la quantificazione del collagene. Questi due strumenti hanno obiettivi principali complementari, ma diversi, e sono in una certa misura collegati tra loro. CT-FIRE può essere lanciato dall’interfaccia CurveAlign per condurre la maggior parte delle operazioni ad eccezione della post-elaborazione avanzata e dell’analisi del ROI. Per un pieno funzionamento di CT-FIRE, dovrebbe essere lanciato separatamente. 1. Raccolta di immagini …

Representative Results

Questi metodi sono stati applicati con successo in numerosi studi. Alcune applicazioni tipiche includono: 1) Conklin etal. 10 ha utilizzato la modalità CT-FIRE in CurveAlign per quantificare l’allineamento del collagene stromale per l’adenocarcinoma duttale pancreatico e i tessuti pancreatititici normali/cronici e ha riscontrato un maggiore allineamento nei tessuti tumorali rispetto a quello dei tessuti normali/cronici; 3) Alkmin et al.7 ha utilizzato</su…

Discussion

Questo protocollo descrive l’uso di CT-FIRE e CurveAlign per la quantificazione del collagene fibrilla e può essere applicato a qualsiasi immagine con fibre di collagene o altre strutture allungate simili a linee o fibre adatte per l’analisi da parte di CT-FIRE o CurveAlign. Ad esempio, l’elastina o le fibre elastiche potrebbero essere lavorate in modo simile su questa piattaforma. Abbiamo testato entrambi gli strumenti sulle fibre sintetiche generate computazally²¹. A seconda dell’applicazione, …

Materials

CT-FIRE	Univerity of Wisconsin-Madison	N/A	open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign	University of Wisconsin-Madison	N/A	open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/