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생체공학

Quantificando a organização do colágeno fibrilar com ferramentas baseadas em curvas

Published: November 11, 2020
doi:
10.3791/61931
,
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging,University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering,University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test,test

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para usar uma ferramenta de software MATLAB baseada em curvas baseada em curvas, de código aberto para quantificar a organização de colágeno fibrilar na matriz extracelular de tecidos normais e doentes. Esta ferramenta pode ser aplicada a imagens com fibras de colágeno ou outros tipos de estruturas semelhantes a linhas.

Abstract

As colagens fibrilares são componentes proeminentes da matriz extracelular (ECM), e suas alterações na topologia têm se mostrado associadas à progressão de uma ampla gama de doenças, incluindo câncer de mama, ovário, rim e pâncreas. As ferramentas de software de quantificação de fibras disponíveis livremente são focadas principalmente no cálculo do alinhamento ou orientação da fibra, e estão sujeitas a limitações como a exigência de etapas manuais, imprecisão na detecção da borda de fibra em fundo barulhento ou falta de caracterização de recursos localizados. A ferramenta de quantitação de fibra de colágeno descrita neste protocolo é caracterizada pelo uso de uma representação de imagem multiescala ideal habilitada pela curvelet transform (CT). Esta abordagem algorítmica permite a remoção do ruído de imagens de colágeno fibrilar e o aprimoramento das bordas de fibra para fornecer informações de localização e orientação diretamente de uma fibra, em vez de usar as informações indiretas em termos de pixels ou janelas obtidas de outras ferramentas. Esta estrutura baseada em CT contém dois pacotes separados, mas vinculados, chamados “CT-FIRE” e “CurveAlign” que podem quantificar a organização de fibras em uma base global, região de interesse (ROI) ou fibra individual. Esta estrutura de quantificação foi desenvolvida há mais de dez anos e agora evoluiu para uma plataforma abrangente e orientada pelo usuário de quantificação de colágeno. Usando esta plataforma, pode-se medir até cerca de trinta recursos de fibra, incluindo propriedades individuais de fibra, como comprimento, ângulo, largura e retidão, bem como medidas em massa, como densidade e alinhamento. Além disso, o usuário pode medir o ângulo de fibra em relação a limites segmentados manualmente ou automaticamente. Esta plataforma também fornece vários módulos adicionais, incluindo os para análise de ROI, criação automática de limites e pós-processamento. O uso desta plataforma não requer experiência prévia de programação ou processamento de imagens, e pode lidar com grandes conjuntos de dados, incluindo centenas ou milhares de imagens, permitindo quantificação eficiente da organização de fibras de colágeno para aplicações biológicas ou biomédicas.

Introduction

As collagens fibrilares são componentes ECM proeminentes e estruturais. Suas mudanças de organização afetam a função tecidual e provavelmente estão associadas à progressão de muitas doenças que vão desde a osteogênese imperfeita1,disfunção cardíaca2, e cicatrização de feridas3 a diferentes tipos de câncer, incluindo mama4,5,6,ovário7,8,rim9e cânceres pancreáticos10. Muitas modalidades de imagem estabelecidas podem ser usadas para visualizar colágeno fibrilar, como microscopia de segunda geração harmônica11,manchas ou corantes em conjunto com microscopia de campo brilhante ou fluorescência ou microscopia de luz polarizada12,microscopia de polarização baseada em cristal líquido (LC-PolScope)13, e microscopia eletrônica14. À medida que a importância da organização do colágeno fibrilar tornou-se mais clara, e o uso desses métodos aumentou, a necessidade de melhores abordagens de análise de fibra de colágeno também cresceu.

Tem havido muitos esforços para desenvolver métodos computacionais para medição automatizada do colágeno fibrilar. As ferramentas de software disponíveis gratuitamente são focadas principalmente no cálculo do alinhamento ou orientação da fibra, adotando o primeiro tensor derivativo ou estrutura para pixels15,16ou análise de espectro baseado em transformação fourier para telhas de imagem17. Todas essas ferramentas estão sujeitas a limitações como a exigência de etapas manuais, imprecisão na detecção da borda de fibra em fundo barulhento ou falta de caracterização de características localizadas.

Em comparação com outras ferramentas de software livre de código aberto disponíveis livremente, os métodos descritos neste protocolo usam CT — um método ideal, multiescala e direcional de representação de imagens — para remover o ruído de imagens de colágeno fibrilar e melhorar ou rastrear bordas de fibra. Informações sobre localização e orientação podem ser fornecidas diretamente de uma fibra, em vez de usar as informações indiretas em termos de pixels ou janelas para inferir as métricas da organização da fibra. Esta estrutura baseada em CT18,19,20,21 pode quantificar a organização de fibras em uma base global, ROI ou fibra, principalmente através de dois pacotes separados, mas vinculados, chamados “CT-FIRE”18,21 e “CurveAlign”19,21. No que diz respeito à implementação do software, no CT-FIRE, coeficientes ct em múltiplas escalas podem ser usados para reconstruir uma imagem que melhore as bordas e reduza o ruído. Em seguida, um algoritmo individual de extração de fibras é aplicado à imagem reconstruída pela TC para rastrear fibras para encontrar seus pontos centrais representativos, estendendo os ramos de fibra dos pontos centrais e ligando galhos de fibra para formar uma rede de fibras. Em CurveAlign, coeficientes de TC em uma escala especificada pelo usuário podem ser usados para rastrear a orientação local da fibra, onde a orientação e os locais das curvas são extraídos e agrupados para estimar a orientação da fibra nos locais correspondentes. Essa estrutura de quantificação resultante foi desenvolvida há mais de dez anos e evoluiu muito em muitos aspectos, como funcionalidade, interface do usuário e modularidade. Por exemplo, esta ferramenta pode visualizar a orientação local de fibras e permite que o usuário meça até trinta recursos de fibra, incluindo propriedades individuais de fibra, como comprimento, ângulo, largura e retidão, bem como medidas a granel, como densidade e alinhamento. Além disso, o usuário pode medir o ângulo de fibra em relação a limites segmentados manualmente ou automaticamente, o que, por exemplo, desempenha um papel importante no desenvolvimento de biomarcadores baseados em imagem no câncer de mama22 e estudos de câncer de pâncreas10. Esta plataforma fornece vários módulos de recursos, incluindo os para análise de ROI, criação automática de limites e pós-processamento. O módulo ROI pode ser usado para anotar diferentes formas de ROI e realizar análises correspondentes de ROI. Como exemplo de aplicação, o módulo de criação de limites automáticos pode ser usado para registrar imagens de campo brilhante de hematoxilina e eosina (H&E) com imagens de segunda geração harmônica (SHG) e gerar a máscara de imagem dos limites do tumor a partir das imagens de H&E registradas. O módulo pós-processamento pode ajudar a facilitar o processamento e integração de arquivos de dados de saída a partir de imagens individuais para possíveis análises estatísticas.

Esta plataforma de quantificação não requer experiência prévia de programação ou processamento de imagens e pode lidar com grandes conjuntos de dados, incluindo centenas ou milhares de imagens, permitindo quantificação eficiente da organização de colágeno para aplicações biológicas ou biomédicas. Tem sido amplamente utilizado em diferentes campos de pesquisa por muitos pesquisadores em todo o mundo, incluindo nós mesmos. Existem quatro publicações principais no CT-FIRE e CurveAlign18,19,20,21, das quais as três primeiras foram citadas 272 vezes (a partir de 2020-05-04 de acordo com o Google Scholar). Uma revisão das publicações que citavam esta plataforma (CT-FIRE ou CurveAlign) indica que há aproximadamente 110 artigos de revistas que a utilizaram diretamente para sua análise, nas quais aproximadamente 35 publicações colaboravam com nosso grupo, e as outras (~ 75) foram escritas por outros grupos. Por exemplo, esta plataforma foi utilizada para os seguintes estudos: câncer de mama22,23,24, câncer de pâncreas10,25, câncer de rim9,26, cicatrização de feridas3,27,28,29,30, câncer de ovário8,31,7, ligamento uterosacral32, hipofosfatomico dentin33, carcinoma basal celular34, sarcoma hipoxic35, tecido cartilagem36, disfunção cardíaca37, neurônios38, glioblastoma39, contrações linfáticas40,cacffolds fibrosas41,câncer gástrico42, microtúbulo43, e fibrose bexiga44. A Figura 1 demonstra a aplicação de imagem de câncer do CurveAlign para encontrar as assinaturas de colágeno associadas ao tumor do câncer de mama19 a partir da imagem shg. A Figura 2 descreve um fluxo de trabalho esquemático típico desta plataforma. Embora essas ferramentas tenham sido revisadas tecnicamente18,19,21, e um protocolo regular20 para análise de alinhamento com CurveAlign também está disponível, um protocolo visual que demonstra que todas as características essenciais poderiam ser úteis. Um protocolo visualizado, como aqui apresentado, facilitará o processo de aprendizagem do uso desta plataforma, bem como abordará de forma mais eficiente preocupações e perguntas que os usuários possam ter.

Protocol

NOTA: Este protocolo descreve o uso de CT-FIRE e CurveAlign para quantificação de colágeno. Essas duas ferramentas têm objetivos complementares, mas diferentes, principais e estão ligadas em conjunto até certo ponto. O CT-FIRE pode ser lançado a partir da interface CurveAlign para realizar a maioria das operações, exceto para análise avançada de pós-processamento e ROI. Para uma operação completa de CT-FIRE, deve ser lançado separadamente. 1. Coleta de imagens e exigência de imag…

Representative Results

Esses métodos têm sido aplicados com sucesso em inúmeros estudos. Algumas aplicações típicas incluem: 1) Conklin et al.22 usaram CurveAlign para calcular assinaturas de colágeno associadas ao tumor, e descobriram que as fibras de colágeno estavam mais frequentemente alinhadas perpendicularmente ao perímetro do ducto em lesões de carcinoma ductal in situ (DCIS); 2) Drifka et al.10 utilizaram o modo CT-FIRE em CurveAlign para quantificar o alinhamento de colágeno e…

Discussion

Este protocolo descreve o uso de CT-FIRE e CurveAlign para quantificação de colágeno fibrilar e pode ser aplicado a qualquer imagem com fibras de colágeno ou outras estruturas alongadas semelhantes a linhas ou fibras adequadas para análise por CT-FIRE ou CurveAlign. Por exemplo, elastina ou fibras elásticas podem ser processadas de forma semelhante nesta plataforma. Testamos ambas as ferramentas em fibras sintéticas geradas computacionalmente21. Dependendo do aplicativo, os usuários devem …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a muitos colaboradores e usuários ao CT-FIRE e CurveAlign ao longo dos anos, incluindo dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik e contribuições técnicas adicionais de Swati Anand e Curtis Rueden. Este trabalho foi apoiado por financiamento da Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research, e nih grants R01CA199996, R01CA181885 e U54CA210190 para K.W.E.

Materials

CT-FIRE Univerity of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign University of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/
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Keywords: Fibrillar CollagenCollagen OrganizationExtracellular MatrixCurvelet TransformCT-FIREImage AnalysisFiber ExtractionRegion Of InterestPost-processing
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Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools. J. Vis. Exp. (165), e61931, doi:10.3791/61931 (2020).
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