Cuantificación de la organización del colágeno fibrilador con herramientas basadas en curvelet transform
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para utilizar una herramienta de software MATLAB de código abierto basada en transformaciones curvas para cuantificar la organización del colágeno fibrilador en la matriz extracelular de los tejidos normales y enfermos. Esta herramienta se puede aplicar a imágenes con fibras de colágeno u otros tipos de estructuras similares a líneas.
Abstract
Los colágenos fibriladores son componentes prominentes de la matriz extracelular (ECM), y se ha demostrado que sus cambios en la topología se asocian con la progresión de una amplia gama de enfermedades, incluyendo cánceres de mama, ovario, riñón y páncreas. Las herramientas de software de cuantificación de fibra disponibles libremente se centran principalmente en el cálculo de la alineación u orientación de la fibra, y están sujetas a limitaciones tales como el requisito de pasos manuales, la imprecisión en la detección del borde de fibra en un fondo ruidoso, o la falta de caracterización de características localizadas. La herramienta de cuantificación de fibra de colágeno descrita en este protocolo se caracteriza por utilizar una representación óptima de imagen multiescala habilitada por transformación curva (TC). Este enfoque algorítmico permite la eliminación del ruido de las imágenes de colágeno fibrilador y la mejora de los bordes de fibra para proporcionar información de ubicación y orientación directamente desde una fibra, en lugar de utilizar la información indirecta en cuanto a píxeles o en la ventana obtenida de otras herramientas. Este marco basado en TC contiene dos paquetes separados, pero vinculados, denominados “CT-FIRE” y “CurveAlign” que pueden cuantificar la organización de fibra a nivel global, región de interés (ROI) o fibra individual. Este marco de cuantificación se ha desarrollado durante más de diez años y ahora se ha convertido en una plataforma integral de cuantificación de colágeno impulsada por el usuario. Con esta plataforma, se pueden medir hasta una treintena de características de fibra, incluyendo propiedades de fibra individuales como longitud, ángulo, anchura y recudimiento, así como mediciones a granel como densidad y alineación. Además, el usuario puede medir el ángulo de fibra en relación con los límites segmentados manual o automáticamente. Esta plataforma también proporciona varios módulos adicionales, incluidos los para el análisis de ROI, la creación automática de límites y el postprocesamiento. El uso de esta plataforma no requiere experiencia previa en programación o procesamiento de imágenes, y puede manejar grandes conjuntos de datos, incluyendo cientos o miles de imágenes, lo que permite una cuantificación eficiente de la organización de fibra de colágeno para aplicaciones biológicas o biomédicas.
Introduction
Los colágenos fibriladores son componentes estructurales prominentes del ECM. Su organización cambia la función del tejido de impacto y probablemente se asocian con la progresión de muchas enfermedades que van desde osteogénesis imperfecta1,disfunción cardíaca2,y cicatrización de heridas3 a diferentes tipos de cáncer incluyendo mama4,5,6,ovario7,8,riñón9,y cánceres de páncreas10. Muchas modalidades de imagen establecidas se pueden utilizar para visualizar colágeno fibrilador como microscopía de segunda generación armónica11,manchas o tintes junto con microscopía de campo brillante o fluorescencia o microscopía de luz polarizada12,microscopía de polarización basada en cristal líquido (LC-PolScope)13y microscopía electrónica14. A medida que la importancia de la organización del colágeno fibrilador se ha vuelto más clara, y el uso de estos métodos ha aumentado, la necesidad de mejorar los enfoques de análisis de fibra de colágeno también ha crecido.
Ha habido muchos esfuerzos para desarrollar métodos computacionales para la medición automatizada del colágeno fibrilador. Las herramientas de software de libre disposición se centran principalmente en el cálculo de la alineación u orientación de la fibra mediante la adopción de primer tensor derivado o estructura para píxeles15,16o fourier transform-based spectrum analysis for image tiles17. Todas estas herramientas están sujetas a limitaciones como el requisito de pasos manuales, la imprecisión en la detección del borde de fibra en un fondo ruidoso o la falta de caracterización de características localizadas.
En comparación con otras herramientas de software libre de código abierto disponibles libremente, los métodos descritos en este protocolo utilizan TC ,un método óptimo, multiescala y de representación de imágenes direccionales, para eliminar el ruido de las imágenes de colágeno fibrilador y mejorar o rastrear los bordes de fibra. La información sobre la ubicación y la orientación se puede proporcionar directamente desde una fibra en lugar de utilizar la información indirecta en píxeles o en función de las ventanas para inferir las métricas de la organización de fibra. Este marco basado en TC18,19,20,21 puede cuantificar la organización de la fibra a nivel global, ROI o fibra, principalmente a través de dos paquetes separados, pero vinculados, llamados “CT-FIRE”18,21 y “CurveAlign”19,21. En lo que respecta a la implementación del software, en CT-FIRE, los coeficientes de TC en múltiples escalas se pueden utilizar para reconstruir una imagen que mejora los bordes y reduce el ruido. A continuación, se aplica un algoritmo de extracción de fibra individual a la imagen reconstruida por TC para realizar un seguimiento de las fibras para encontrar sus puntos centrales representativos, extender las ramas de fibra desde los puntos centrales y vincular las ramas de fibra para formar una red de fibra. En CurveAlign, los coeficientes ct en una escala especificada por el usuario se pueden utilizar para realizar un seguimiento de la orientación de la fibra local, donde se extraen y agrupan la orientación y las ubicaciones de las curvas para estimar la orientación de la fibra en las ubicaciones correspondientes. Este marco de cuantificación resultante se ha desarrollado durante más de diez años y ha evolucionado mucho en muchos aspectos como la funcionalidad, la interfaz de usuario y la modularidad. Por ejemplo, esta herramienta puede visualizar la orientación local de la fibra y permite al usuario medir hasta treinta entidades de fibra, incluidas propiedades de fibra individuales como longitud, ángulo, anchura y recudez, así como mediciones a granel como densidad y alineación. Además, el usuario puede medir el ángulo de fibra en relación con los límites segmentados manual o automáticamente, lo que, por ejemplo, desempeña un papel importante en el desarrollo de biomarcador basado en imágenes en el cáncer de mama22 y estudios de cáncer de páncreas10. Esta plataforma proporciona varios módulos de características, incluidos los de análisis de ROI, creación automática de límites y postprocesamiento. El módulo roi se puede utilizar para anotar diferentes formas de ROI y realizar el análisis de ROI correspondiente. Como ejemplo de aplicación, el módulo de creación automática de límites se puede utilizar para registrar imágenes de campo brillante de hematoxilina y eosina (H&E) con imágenes de segunda generación armónica (SHG) y generar la máscara de imagen de los límites tumorales a partir de las imágenes H&E registradas. El módulo de postprocesamiento puede ayudar a facilitar el procesamiento y la integración de archivos de datos de salida a partir de imágenes individuales para un posible análisis estadístico.
Esta plataforma de cuantificación no requiere experiencia previa en programación o procesamiento de imágenes y puede manejar grandes conjuntos de datos, incluidas cientos o miles de imágenes, lo que permite una cuantificación eficiente de la organización del colágeno para aplicaciones biológicas o biomédicas. Ha sido ampliamente utilizado en diferentes campos de investigación por muchos investigadores de todo el mundo, incluyendo nosotros mismos. Hay cuatro publicaciones principales en CT-FIRE y CurveAlign18,19,20,21, de las cuales las tres primeras han sido citadas 272 veces (a partir de 2020-05-04 según Google Scholar). Una revisión de las publicaciones que citaron esta plataforma (CT-FIRE o CurveAlign) indica que hay aproximadamente 110 artículos de revistas que la utilizaron directamente para su análisis, en los que aproximadamente 35 publicaciones fueron en colaboración con nuestro grupo, y las otras (~ 75) fueron escritas por otros grupos. Por ejemplo, esta plataforma se utilizó para los siguientes estudios: cáncer de mama22,23,24,cáncer de páncreas10,25,cáncer de riñón9,26,cicatrización de heridas3,27,28,29,30,cáncer de ovario8,31,7,ligamento uterosacral32,antítesis hipofosfatémicotin33,carcinoma basocelular34,sarcoma hipoxico35,tejido cartílago36,disfunción cardíaca37,neuronas38,glioblastoma39,contracciones linfáticas40,cacffolds fibrosos41,cáncer gástrico42,microtúbulo43y fibrosis vesical44. Figura 1 demuestra la aplicación de imágenes de cáncer de CurveAlign para encontrar las firmas de colágeno asociadas al tumor de cáncer de mama19 de la imagen SHG. En la figura 2 se describe un flujo de trabajo esquemático típico de esta plataforma. Aunque estas herramientas se han revisado técnicamente18,19,21y también está disponible un protocolo regular20 para el análisis de alineación con CurveAlign, también está disponible un protocolo visual que demuestra que todas las características esenciales podrían ser útiles. Un protocolo visualizado, tal como se presenta aquí, facilitará el proceso de aprendizaje del uso de esta plataforma, así como abordar de manera más eficiente las preocupaciones y preguntas que los usuarios podrían tener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el uso de CT-FIRE y CurveAlign para la cuantificación de colágeno fibrilador y se puede aplicar a cualquier imagen con fibras de colágeno u otras estructuras alargadas similares a líneas o similares a fibras adecuadas para su análisis por CT-FIRE o CurveAlign. Por ejemplo, las fibras elastinas o elásticas podrían procesarse de manera similar en esta plataforma. Hemos probado ambas herramientas en fibras sintéticas generadas computacionalmente21. Dependiendo de la ap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a muchos contribuyentes y usuarios a CT-FIRE y CurveAlign a lo largo de los años, incluyendo el Dr. Rob Nowak, la Dra. Carolyn Pehlke, el Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, el Dr. Adib Keikhosravi, el Dr. Matt Conklin, el Dr. Jayne Squirrell, el Dr. Paolo Provenzano, la Dra. Brenda Ogle, la Dra. Patricia Keely, el Dr. Joseph Szulczewski, la Dra. Suzanne Ponik y contribuciones técnicas adicionales de Swati Anand y Curtis Rueden. Este trabajo fue apoyado por fondos de Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research y NIH grants R01CA199996, R01CA181385 y U54CA210190 a K.W.E.
Materials
| CT-FIRE | Univerity of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/ |
| CurveAlign | University of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/ |
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