Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L
Summary
I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell’aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.
Abstract
I modelli murini svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull’aritmia e consentono di studiare i meccanismi chiave dell’aritmogenesi, tra cui l’alterata funzione dei canali ionici e la manipolazione del calcio. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti atriali o ventricolari di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp o per esplorare anomalie di manipolazione del calcio. Tuttavia, la resa limitata di cardiomiociti di alta qualità ottenuti dagli attuali protocolli di isolamento non consente entrambe le misurazioni nello stesso topo. Questo articolo descrive un metodo per isolare miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, per successive misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L da un animale. Si ottengono cuori di topo e l’aorta viene rapidamente incannulata per rimuovere il sangue. I cuori vengono quindi inizialmente perfusi con una soluzione priva di calcio (37 °C) per dissociare il tessuto a livello dei dischi intercalati e successivamente con una soluzione enzimatica contenente poco calcio per distruggere la matrice extracellulare (37 °C). Il cuore digerito viene successivamente sezionato in atri e ventricoli. I campioni di tessuto vengono tagliati in piccoli pezzi e sciolti mediante pipettaggio accurato su e giù. La digestione enzimatica viene interrotta e le cellule vengono gradualmente reintrodotte alle concentrazioni fisiologiche di calcio. Dopo il caricamento con un indicatore fluorescente Ca2+, i cardiomiociti isolati vengono preparati per la misurazione simultanea di correnti di calcio e transitori. Inoltre, vengono discusse le insidie dell’isolamento e vengono forniti protocolli patch-clamp e tracce rappresentative di correnti di calcio di tipo L con misurazioni simultanee dei transitori di calcio in miociti murini atriali e ventricolari isolati come descritto sopra.
Introduction
Le aritmie cardiache sono comuni e rappresentano una delle principali sfide sanitarie attuali poiché colpiscono milioni di persone in tutto il mondo. Le aritmie sono associate ad elevata morbilità e mortalità 1,2 e rappresentano la causa sottostante della maggior parte delle morti cardiache improvvise3. Le opzioni di trattamento aggiornate hanno migliorato la sopravvivenza dei pazienti, ma sono ancora principalmente trattamenti sintomatici piuttosto che mirati ai meccanismi sottostanti. Pertanto, questi trattamenti hanno un’efficacia limitata e possono spesso causare gravi effetti collaterali 4,5,6. Un miglioramento delle attuali opzioni di trattamento richiede una comprensione della fisiopatologia sottostante, creando la necessità di modelli adatti da studiare. I piccoli modelli animali – e in particolare i modelli murini – svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull’aritmia in quanto consentono di studiare i meccanismi chiave dell’aritmogenesi, ad esempio l’impatto genetico sull’elettrofisiologia cellulare, la funzione dei canali ionici o la manipolazione del calcio 7,8.
A tale scopo sono necessari cardiomiociti atriali e ventricolari isolati di quantità e vitalità sufficienti. Un ampio spettro di diversi approcci di isolamento per ottenere miociti atriali e ventricolari è stato precedentemente descritto 9,10,11,12,13 e alcuni gruppi hanno presentato dati da misurazioni simultanee di transitori di calcio indotti da corrente di tipo L e transitori di calcio indotti da corrente atriale 14 o ventricolare 15 cardiomiociti murini. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, non sono disponibili dati sulle misurazioni atriali e ventricolari di un animale. I ricercatori si concentrano su un’ampia varietà di argomenti che vanno dall’elettrofisiologia alla proteomica, studi funzionali come contrattilità cellulare o interazioni proteiche, funzione mitocondriale o genetica – tutti che necessitano di cardiomiociti isolati. Molti dei protocolli pubblicati non sono stati quindi sviluppati specificamente per gli studi sui patch morb, portando a rese limitate e qualità delle celle insufficiente per gli studi sui patch morb. Pertanto, le misurazioni simultanee di patch clamp e transitori di calcio di cellule atriali e ventricolari isolate da un animale non possono essere eseguite con protocolli stabiliti.
L’isolamento dei miociti murini, specialmente atriali, per gli esperimenti di patch clamp rimane impegnativo. Questo articolo fornisce un metodo semplice e veloce per l’isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, che consente successivamente misurazioni simultanee sia della corrente netta di membrana che dei transitori di calcio indotti dalla corrente da un animale. Questo articolo elabora un protocollo per l’isolamento di miociti atriali e ventricolari derivati da topi wild type e topi portatori di mutazioni genetiche. Questo protocollo può essere utilizzato sia per i topi maschi che per le femmine. L’isolamento dei miociti, le immagini e i risultati rappresentativi descritti di seguito sono stati ottenuti da topi selvatici tipo C57Bl/6 all’età di 6 (± 1) mesi. Tuttavia, questo protocollo è stato utilizzato con successo per topi di varie età che vanno da 2 a 24 mesi con genotipi diversi. La Figura 1 mostra la configurazione dell’isolamento e un primo piano di un cuore cannulato durante la perfusione enzimatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo fornisce un modo semplice e funzionale per ottenere miociti atriali e ventricolari di alta qualità dallo stesso topo per studi patch-clamp con registrazioni simultanee di transitori di calcio. La qualità dei dati ottenuti dipende fortemente dalla qualità dell’isolamento cellulare. Come accennato in precedenza, molti metodi per isolare cardiomiociti murini sono stati descritti in precedenza 9,10,11,12.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. Tomsits e D. Schüttler; VO1568/3-1, progetto IRTG1816 e SFB1002 A13 a N. Voigt), Fondazione tedesca per la ricerca nell’ambito della strategia di eccellenza tedesca (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss e N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), l’ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss) e la Fondazione Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 a N. Voigt). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
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